Ein einfacher mikrofluidischer Chip für Langzeitwachstum und Bildgebung von Caenorhabditis elegans

Summary

Das Protokoll beschreibt ein einfaches mikrofluidisches Chipdesign und eine Mikrofabrikationsmethodik, die verwendet wird, um C. elegans in Gegenwart einer kontinuierlichen Nahrungszufuhr für bis zu 36 h zu züchten. Das Wachstums- und Bildgebungsgerät ermöglicht auch eine intermittierende langfristige hochauflösende Bildgebung von zellulären und subzellulären Prozessen während der Entwicklung für mehrere Tage.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) haben sich als wertvolles Modellsystem zur Untersuchung entwicklungs- und zellbiologischer Prozesse erwiesen. Um diese biologischen Prozesse zu verstehen, ist oft eine langfristige und wiederholte Bildgebung desselben Tieres erforderlich. Lange Erholungszeiten, die mit herkömmlichen Immobilisierungsmethoden auf Agarpads verbunden sind, haben schädliche Auswirkungen auf die Tiergesundheit, so dass es unangemessen ist, dasselbe Tier über lange Zeiträume hinweg wiederholt abzubilden. Dieser Artikel beschreibt ein mikrofluidisches Chipdesign, eine Herstellungsmethode, ein On-Chip-C . elegans-Kulturprotokoll und drei Beispiele für Langzeitbildgebung zur Untersuchung von Entwicklungsprozessen bei einzelnen Tieren. Der mit Polydimethylsiloxan hergestellte und auf einem Deckglas verklebte Chip immobilisiert Tiere auf einem Glassubstrat mit einer Elastomermembran, die mit Stickstoffgas abgelenkt wird. Die vollständige Immobilisierung von C. elegans ermöglicht eine robuste Zeitraffer-Bildgebung von zellulären und subzellulären Ereignissen in einer anästhesiefreien Weise. Eine Kanalgeometrie mit großem Querschnitt ermöglicht es dem Tier, sich innerhalb von zwei teilweise abgedichteten Isolationsmembranen frei zu bewegen, was ein Wachstum im Kanal mit kontinuierlicher Nahrungszufuhr ermöglicht. Mit diesem einfachen Chip kann die Bildgebung von Entwicklungsphänomenen wie neuronalem Prozesswachstum, Vulvaentwicklung und dendritischen Arborisation in den PVD-sensorischen Neuronen durchgeführt werden, wenn das Tier im Kanal wächst. Der Langzeitwachstums- und Bildgebungschip arbeitet mit einer einzigen Druckleitung, ohne externe Ventile, kostengünstigen fluidischen Verbrauchsmaterialien und verwendet Standard-Schneckenbehandlungsprotokolle, die von anderen Labors mit C. elegans leicht angepasst werden können.

Introduction

Caenorhabditis elegans hat sich als leistungsfähiger Modellorganismus erwiesen, um Zellbiologie, Alterung, Entwicklungsbiologie und Neurobiologie zu untersuchen. Vorteile wie sein transparenter Körper, kurzer Lebenszyklus, einfache Wartung, eine definierte Anzahl von Zellen, Homologie mit mehreren menschlichen Genen und gut untersuchte Genetik haben dazu geführt, dass C. elegans zu einem beliebten Modell sowohl für grundlegende biologische Entdeckungen als auch für angewandte Forschung geworden^{ist 1,2}. Das Verständnis der biologischen und Entwicklungsprozesse von Zellen durch wiederholte Langzeitbeobachtungen einzelner Tiere kann sich als vorteilhaft erweisen. Herkömmlicherweise wird C. elegans auf Agarpads betäubt und unter dem Mikroskop abgebildet. Schädliche Auswirkungen von Anästhetika auf die Gesundheit von Tieren beschränken die Verwendung von betäubten Tieren für die langfristige und wiederholte intermittierende Bildgebung desselben Tieres ^3,4. Jüngste Fortschritte in der mikrofluidischen Technologie und ihre Anpassung an das anästhesiefreie Fangen von C. elegans mit vernachlässigbaren Gesundheitsgefahren ermöglichen eine hochauflösende Bildgebung desselben Tieres über einen kurzen und langen Zeitraum.

Mikrofluidische Chips wurden für ^das Hochdurchsatz-Screening ^6,7,8 von C. elegans5, das Fangen und Dosieren 9, das Arzneimittelscreening^10,11, die Neuronenstimulation mit hochauflösender Bildgebung 12 und die hochauflösende Bildgebung des Tieres^12,13,14 entwickelt. Ultradünne mikrofluidische Folien für die Immobilisierung auf Objektträgern wurden ebenfalls entwickelt¹⁵. Langzeitstudien von C. elegans wurden unter Verwendung von niedrig aufgelösten Bildern von Tieren durchgeführt, die in flüssiger Kultur wachsen, um Wachstum, Kalziumdynamik, Arzneimittelwirkungen auf ihr Verhalten^16,17,18,19, ihre Langlebigkeit und Alterung²⁰ zu beobachten. Langzeitstudien mit hochauflösender Mikroskopie wurden durchgeführt, um die synaptische Entwicklung²¹, die neuronale Regeneration 22 und die mitochondriale Addition²³ zu bewerten. Langfristige hochauflösende Bildgebung und Verfolgung des Zellschicksals und der Zelldifferenzierung wurden in Mehrkanalgeräten^{durchgeführt 24,25}. Mehrere zelluläre und subzelluläre Ereignisse treten über Zeitskalen von mehreren Stunden auf und erfordern das Einfangen desselben Individuums zu verschiedenen Zeitpunkten während ihrer Entwicklung, um alle Zwischenschritte im Prozess zu charakterisieren, um die zelluläre Dynamik in vivo zu verstehen. Um biologische Prozesse wie Organogenese, neuronale Entwicklung und Zellmigration abzubilden, muss das Tier zu mehreren Zeitpunkten in der gleichen Ausrichtung immobilisiert werden. Wir haben zuvor ein Protokoll für hochauflösende Bildgebung von C. elegans für mehr als 36 Stunden veröffentlicht, um zu bestimmen, wo Mitochondrien entlang der Berührungsrezeptorneuronen (TRNs) hinzugefügt ^werden23.

Dieses Papier enthält ein Protokoll zur Etablierung einer mikrofluidikbasierten Methodik für wiederholte hochauflösende Bildgebung. Dieses Gerät mit einem einzigen Strömungskanal eignet sich am besten für die wiederholte Abbildung eines einzelnen Tieres pro Gerät. Um den Durchsatz zu verbessern und viele Tiere gleichzeitig abzubilden, können mehrere Geräte an dieselbe Druckleitung angeschlossen werden, jedoch mit separaten Drei-Wege-Anschlüssen, die ein einzelnes Tier in jedem Gerät steuern. Das Design ist nützlich für Studien, die hochauflösende Zeitrafferbilder erfordern, wie postembryonale Entwicklungsprozesse, Zellmigration, Organellentransport, Genexpressionsstudien usw. Die Technologie könnte für einige Anwendungen wie Lebensdauer- und Alterungsstudien, die paralleles Wachstum und Bildgebung vieler Tiere im Spätstadium erfordern, einschränkend sein. Polydimethylsiloxan (PDMS) -Elastomer wurde aufgrund seiner Biostabilität²⁶, Biokompatibilität ^27,28, Gaspermeabilität ^29,30 und des abstimmbaren Elastizitätsmoduls ³¹ zur Herstellung dieses Geräts verwendet. Diese zweischichtige Vorrichtung ermöglicht das Wachstum von Tieren mit kontinuierlicher Nahrungszufuhr in einem mikrofluidischen Kanal und das Einfangen einzelner C. elegans mittels PDMS-Membrankompression mit Stickstoffgas. Dieses Gerät ist eine Erweiterung des zuvor veröffentlichten Geräts mit dem Vorteil, das gleiche Tier im Mikrokanal unter einer kontinuierlichen Nahrungszufuhr zu züchten und abzubilden³. Das zusätzliche Isoliermembrannetz und eine 2 mm breite Fangmembran ermöglichen eine effiziente Immobilisierung von sich entwickelnden Tieren. Das Gerät wurde verwendet, um neuronale Entwicklung, Vulvaentwicklung und dendritische Arborisierung in sensorischen PVD-Neuronen zu beobachten. Die Tiere wachsen ohne gesundheitsschädliche Auswirkungen im Gerät und können wiederholt immobilisiert werden, um die Bildgebung subzellulärer Ereignisse im selben Tier während seiner Entwicklung zu erleichtern.

Das gesamte Protokoll gliedert sich in fünf Teile. Teil 1 beschreibt die Geräteherstellung für den Wachstums- und Bildgebungschip. Teil 2 beschreibt, wie ein Drucksystem für die PDMS-Membranauslenkung eingerichtet wird, um einzelne C. elegans zu immobilisieren und zu isolieren. Teil 3 beschreibt, wie C. elegans auf einer Nematoden-Wachstumsmedium-Platte (NGM) für die Gerätebildgebung synchronisiert wird. Teil 4 beschreibt, wie man ein einzelnes Tier in das Gerät lädt und das Tier mehrere Tage lang in das mikrofluidische Gerät züchtet. Teil 5 beschreibt, wie man ein einzelnes Tier zu mehreren Zeitpunkten immobilisiert, hochauflösende Bilder mit verschiedenen Zielen aufnimmt und die Bilder mit Fidschi analysiert.

Protocol

1. Herstellung von Wachstums- und Bildgebungsgeräten SU8 FormenbauEntwerfen Sie die Muster 1 (Fließschicht) und 2 (Kontrollschicht) unter Verwendung rechteckiger Formen in einer Textverarbeitungssoftware (oder einer computergestützten Design-CAD-Software) und drucken Sie die Fotomasken mit Hilfe eines Laserplotters mit einer Mindeststrukturgröße von 8 μm auf Polyesterfolie (Abbildung 1). Siliziumwafer in 2,5 cm × 2,5 cm große Stücke schn…

Representative Results

Gerätecharakterisierung: Das Wachstums- und Bildgebungsgerät besteht aus zwei PDMS-Schichten, die mittels irreversibler Plasmabindung miteinander verbunden sind (Abbildung 1). Die Fließschicht (Muster 1), die 10 mm lang und 40 μm oder 80 μm hoch ist, ermöglicht es uns, das Tier in flüssiger Kultur zu züchten (Abbildung 1A). Die Fangschicht (Muster 2) hat eine 2 mm breite Membran (Abbildung 1B) zur Immobilis…

Discussion

In dieser Arbeit wurde ein Protokoll für die Herstellung und Verwendung einer einfachen mikrofluidischen Vorrichtung für den Anbau von C. elegans mit konstanter Nahrungszufuhr und hochauflösender Bildgebung eines einzelnen Tieres während seiner Entwicklung beschrieben. Dieser Herstellungsprozess ist einfach und kann in einer nicht sterilen Umgebung durchgeführt werden. Eine staubfreie Umgebung ist während der Fertigungsschritte kritisch. Das Vorhandensein von Staubpartikeln würde zu einem unsachgemäßen …

Materials

18 G needles	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	Gauge 18
3-way stopcock	Cole-Parmer	WW-30600-02	Masterflex fitting with luer lock
CCD camera	Andor Technology	EMCCD C9100-13no
Circuit board film	Fine Line Imaging, Colorado, USA		The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven	Meta-Lab Scientific Industries, India	MSI-5
Coverslips	Blue stat microscopic cover glass		22mm x 10Gms
Ethanol	Hi media
Harris uni-core puncher 1mm	Qiagen	Z708801
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	440191
Hot plate	IKA	RCT B S 22
Isopropanol	Fisher Scientific	26895
KOH	Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope	ZEISS	LSM 5 LIVE
Micropipette tips	Tarsons		0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1	Microchem	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2	Microchem	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas	Local Supplier	Commercial nitrogen gas	Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard curing solution	curing agent
Petri plates	Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-32G
Razor and blades	Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard 184 base	elastomer base
Silicon tubes	Fisher Scientific		Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer	University Wafer, MA, USA	[100] orientation, 4-inch diameter	Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater	SPS-Europe B.V., The Netherlands	SPIN 150
Spinning Disk microscope	Perkin Elmer ultra-view VOX system	CSU-X1-A3 N	The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer	Microchem, MA, USA	SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	448931	Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp	Oriel Instruments, Bangalore, India		200 Watt and collimated UV light source
Volocity software	Perkin-Elmer		Image analysis