Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

Summary

O protocolo descreve um projeto de chip microfluídico simples e metodologia de microfabricação usada para cultivar C. elegans na presença de um suprimento contínuo de alimentos por até 36 h. O dispositivo de crescimento e imagem também permite imagens intermitentes de alta resolução a longo prazo de processos celulares e subcelulares durante o desenvolvimento por vários dias.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) provou ser um valioso sistema modelo para o estudo de processos biológicos de desenvolvimento e celular. Compreender esses processos biológicos geralmente requer imagens de longo prazo e repetidas do mesmo animal. Longos tempos de recuperação associados a métodos convencionais de imobilização feitos em almofadas de ágar têm efeitos prejudiciais sobre a saúde animal, tornando inadequado fotografar repetidamente o mesmo animal por longos períodos de tempo. Este artigo descreve um projeto de chip microfluídico, método de fabricação, protocolo de cultivo de C. elegans em chip e três exemplos de imagens de longo prazo para estudar processos de desenvolvimento em animais individuais. O chip, fabricado com polidimetilsiloxano e ligado em um vidro de cobertura, imobiliza os animais em um substrato de vidro usando uma membrana elastomérica que é desviada usando gás nitrogênio. A imobilização completa de C. elegans permite imagens robustas de lapso de tempo de eventos celulares e subcelulares de maneira livre de anestésico. Uma geometria do canal com uma grande seção transversal permite que o animal se mova livremente dentro de duas membranas de isolamento parcialmente seladas, permitindo o crescimento no canal com um suprimento contínuo de alimentos. Usando este chip simples, a imagem de fenômenos de desenvolvimento, como o crescimento do processo neuronal, o desenvolvimento vulvar e a arborização dendrítica nos neurônios sensoriais PVD, à medida que o animal cresce dentro do canal, pode ser realizada. O chip de crescimento e imagem a longo prazo opera com uma única linha de pressão, sem válvulas externas, consumíveis fluídicos baratos e utiliza protocolos padrão de manuseio de vermes que podem ser facilmente adaptados por outros laboratórios usando C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans provou ser um poderoso organismo modelo para estudar biologia celular, envelhecimento, biologia do desenvolvimento e neurobiologia. Vantagens como seu corpo transparente, ciclo de vida curto, fácil manutenção, número definido de células, homologia com vários genes humanos e genética bem estudada levaram C. elegans a se tornar um modelo popular tanto para descobertas de biologia fundamental quanto para pesquisas aplicadas ^1,2. Compreender os processos biológicos e de desenvolvimento das células a partir de repetidas observações a longo prazo de animais individuais pode r....

Protocol

1. Fabricação de crescimento e dispositivo de imagem

1. Fabricação de moldes SU8
   1. Projete os padrões 1 (camada de fluxo) e 2 (camada de controle) usando formas retangulares em um software de processamento de texto (ou um software CAD de projeto auxiliado por computador) e imprima as fotomáscaras com a ajuda de um plotter a laser com um tamanho mínimo de recurso de 8 μm em filme à base de poliéster (Figura 1).
   2. Corte as bolachas de silício em pedaços de 2,5 cm × 2,5 cm e limpe-as com 20% KOH durante 1 min. Lave as bolachas em água deionizada (DI). Use uma bolacha cada para o fluxo e a camada de contr....

Results

Caracterização do dispositivo: O dispositivo de crescimento e imagem consiste em duas camadas PDMS unidas (Figura 1) usando ligação de plasma irreversível. A camada de fluxo (padrão 1) que tem 10 mm de comprimento e 40 μm ou 80 μm de altura nos permite cultivar o animal em cultura líquida (Figura 1A). A camada de aprisionamento (padrão 2) possui uma membrana de 2 mm de largura (Figura 1B) para imobilização do anima.......

Discussion

Neste trabalho, um protocolo para fabricação e uso de um dispositivo microfluídico simples para o cultivo de C. elegans com suprimento constante de alimentos e imagens de alta resolução de um único animal durante seu desenvolvimento foi descrito. Este processo de fabricação é simples e pode ser feito em um ambiente não estéril. Um ambiente livre de poeira é fundamental durante as etapas de fabricação. A presença de partículas de poeira levaria ao contato inadequado entre as duas superfícies de ligação, resultand.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agulhas de 18 G	Sigma-Aldrich, Bangalore, Índia	Gauge 18
	Cole-Parmer	WW-30600-02	Encaixe Masterflex com trava luer
Câmera CCD	Andor Technology EMCCD	C9100-13no
Placa de circuito Fine	Line Imaging, Colorado, EUA		Os designs são impressos com 65.024 pontos por polegada (DPI)
Forno de Convecção	Meta-Lab Scientific Industries, Índia	MSI-5
Lamínulas		de cobertura microscópico azul	22mm x 10Gms
Etanol	Hi media
Harris uni-core puncher 1mm	Qiagen	Z708801
Hexametildisilazane	Sigma-Aldrich, Bangalore, Índia	440191
Placa	quente  IKA	RCT B S 22
Isopropanol	Fisher Scientific	26895
KOH	Fisher Scientific
	ZEISS	LSM 5 LIVE
Pontas de micropipeta	Tarsons		0.5-10 µ As pontas de micropipeta L são usadas para fornecimento de alimentos
Negativo Fotorresistente-1	Microchem	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negativo Fotorresistente-2	Microquímico	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Gás nitrogênio	Fornecedor local	Gás nitrogênio comercial	Volume do cilindro de 7 metros cúbicos
PDMS (solução de cura)	Dow Corning Corporation, MI, EUA&	nbsp; Solução de cura Sylgard	agente de cura Placas Petri
	Praveen Scientific Corporation
Limpador de plasma	Harrick Plasma, NY, EUA&	nbsp; PDC-32G
Navalha e lâminas	Lister lâmina cirúrgica
Elastômero de silício (base)	Dow Corning Corporation, MI, EUA	Sylgard 184 base	de elastômero base
Tubos de silicone	Fisher Scientific		Tubos de plástico com o diâmetro interno de 1,59 mm e o diâmetro externo de 3,18 mm
Wafer de silício	University Wafer, MA, EUA	[100] orientação, 4 polegadas de diâmetro	Pequenos pedaços (2 mm e 2 mm) foram cortados de wafer de 100 mm de diâmetro
Spin Coater	SPS-Europe B.V., Holanda	SPIN 150
	Sistema VOX de ultra-visão Perkin Elmer	CSU-X1-A3 N	O sistema foi equipado com quatro lasers (405/488/561/640 nm) e controlado com o pacote de software Volocity.
Desenvolvedor SU8	Microchem, MA, EUA	SU8 Desenvolvedor
Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano	Sigma-Aldrich, Bangalore, Índia	448931	O vapor de silano de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H, 2H-perfluorooctil) é
uma lâmpada UV	Oriel Instruments, Bangalore, Índia		200 Watts e fonte de luz UV colimada
Software Volocity	Perkin-Elmer		análise