केनोरहाब्डिस एलिगेंस के दीर्घकालिक विकास और इमेजिंग के लिए एक सरल माइक्रोफ्लुइडिक चिप
Summary
प्रोटोकॉल एक सरल माइक्रोफ्लुइडिक चिप डिजाइन और माइक्रोफैब्रिकेशन पद्धति का वर्णन करता है जिसका उपयोग 36 घंटे तक निरंतर खाद्य आपूर्ति की उपस्थिति में सी एलिगेंस को विकसित करने के लिए किया जाता है। विकास और इमेजिंग डिवाइस कई दिनों के लिए विकास के दौरान सेलुलर और उप-सेलुलर प्रक्रियाओं के आंतरायिक दीर्घकालिक उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को भी सक्षम बनाता है।
Abstract
केनोरहाब्डिस एलिगेंस (सी एलिगेंस) विकास और कोशिका जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली साबित हुई है। इन जैविक प्रक्रियाओं को समझने के लिए अक्सर एक ही जानवर की दीर्घकालिक और बार-बार इमेजिंग की आवश्यकता होती है। अगर पैड पर किए गए पारंपरिक स्थिरीकरण विधियों से जुड़े लंबे समय तक पुनर्प्राप्ति समय का पशु स्वास्थ्य पर हानिकारक प्रभाव पड़ता है, जिससे लंबे समय तक एक ही जानवर को बार-बार चित्रित करना अनुचित हो जाता है। यह पेपर एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप डिजाइन, निर्माण विधि, ऑन-चिप सी एलिगेंस संवर्धन प्रोटोकॉल, और व्यक्तिगत जानवरों में विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए दीर्घकालिक इमेजिंग के तीन उदाहरणों का वर्णन करता है। चिप, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन के साथ निर्मित और एक कवर ग्लास पर बंधी हुई, एक इलास्टोमेरिक झिल्ली का उपयोग करके ग्लास सब्सट्रेट पर जानवरों को स्थिर करती है जिसे नाइट्रोजन गैस का उपयोग करके विक्षेपित किया जाता है। एलिगेंस का पूर्ण स्थिरीकरण एक एनेस्थेटिक-मुक्त तरीके से सेलुलर और उप-सेलुलर घटनाओं की मजबूत टाइम-लैप्स इमेजिंग को सक्षम बनाता है। एक बड़े क्रॉस-सेक्शन के साथ एक चैनल ज्यामिति जानवर को दो आंशिक रूप से सील किए गए अलगाव झिल्ली के भीतर स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति देती है जो निरंतर खाद्य आपूर्ति के साथ चैनल में वृद्धि की अनुमति देती है। इस सरल चिप का उपयोग करके, पीवीडी संवेदी न्यूरॉन्स में न्यूरोनल प्रक्रिया वृद्धि, वल्वल विकास और डेंड्राइटिक आर्बराइजेशन जैसी विकासात्मक घटनाओं की इमेजिंग की जा सकती है, क्योंकि जानवर चैनल के अंदर बढ़ता है। दीर्घकालिक विकास और इमेजिंग चिप एक एकल दबाव रेखा, कोई बाहरी वाल्व नहीं, सस्ती तरल पदार्थ उपभोग्य सामग्रियों के साथ काम करती है, और मानक वर्म हैंडलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करती है जिसे आसानी से सी एलिगेंस का उपयोग करके अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
केनोरहाब्डिस एलिगेंस सेल बायोलॉजी, एजिंग, डेवलपमेंट बायोलॉजी और न्यूरोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव साबित हुआ है। इसके पारदर्शी शरीर, लघु जीवन चक्र, आसान रखरखाव, कोशिकाओं की एक परिभाषित संख्या, कई मानव जीनों के साथ होमोलॉजी और अच्छी तरह से अध्ययन किए गए आनुवंशिकी जैसे लाभों ने सी एलिगेंस को मौलिक जीव विज्ञान खोजों और लागू अनुसंधानदोनों के लिए एक लोकप्रिय मॉडल बनने के लिए प्रेरित किया है। व्यक्तिगत जानवरों के बार-बार दीर्घकालिक अवलोकन से सेल की जैविक और विकासात्मक प्रक्रियाओं को समझना फायदेमंद साबित हो सकता है। पारंपरिक रूप से, सी एलिगेंस को एगर पैड पर एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है और माइक्रोस्कोप के तहत चित्रित किया जाता है। जानवरों के स्वास्थ्य पर एनेस्थेटिक्स के प्रतिकूल प्रभाव एक ही जानवर के दीर्घकालिक और बार-बार आंतरायिक इमेजिंग के लिए एनेस्थेटाइज्ड जानवरों के उपयोग को सीमित करते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों में हालिया प्रगति और नगण्य स्वास्थ्य खतरों के साथ सी एलिगेंस के एनेस्थेटिक-मुक्त फंसने के लिए उनका अनुकूलन एक ही जानवर की छोटी और लंबी अवधि में उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम करता है।
माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स को सी एलिगेंस के 5 उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग 6,7,8, ट्रैपिंग और डिस्पेंसिंग9, ड्रग स्क्रीनिंग 10,11, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग 12 के साथ न्यूरॉन उत्तेजना और पशु12,13,14 के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है। स्लाइडों पर स्थिरीकरण के लिए अल्ट्रा-पतली माइक्रोफ्लुइडिक शीटभी विकसित की गईहैं। एलिगेंस के दीर्घकालिक अध्ययन तरल संस्कृति में बढ़ने वाले जानवरों की कम-रिज़ॉल्यूशन छवियों का उपयोग करके विकास, कैल्शियम गतिशीलता, उनके व्यवहार पर दवा के प्रभाव16,17,18,19, उनकी दीर्घायु औरउम्र बढ़ने 20 का निरीक्षण करने के लिए किए गए हैं। उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके दीर्घकालिक अध्ययन सिनैप्टिक विकास21, न्यूरोनल पुनर्जनन22 और माइटोकॉन्ड्रियल जोड़23 का आकलन करने के लिए किए गए हैं। मल्टीचैनल उपकरणों24,25 में दीर्घकालिक उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग और सेल भाग्य और भेदभाव का पता लगाने का काम किया गया है। कई सेलुलर और उप-सेलुलर घटनाएं कई घंटों के समय के पैमाने पर होती हैं और विवो में सेलुलर गतिशीलता को समझने की प्रक्रिया में सभी मध्यवर्ती चरणों को चिह्नित करने के लिए उनके विकास के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर एक ही व्यक्ति को फंसाने की आवश्यकता होती है। ऑर्गेनोजेनेसिस, न्यूरोनल विकास और सेल माइग्रेशन जैसी जैविक प्रक्रिया की छवि बनाने के लिए, जानवर को कई समय बिंदुओं पर एक ही अभिविन्यास में स्थिर करने की आवश्यकता होती है। हमने पहले 36 घंटे से अधिक समय तक सी एलिगेंस की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रकाशित किया है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स (टीआरएन) 23 के साथ माइटोकॉन्ड्रिया कहां जोड़ा जाता है।
यह पेपर बार-बार उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित पद्धति स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। एकल प्रवाह चैनल के साथ यह उपकरण, प्रति डिवाइस एक एकल जानवर की बार-बार इमेजिंग के लिए सबसे उपयुक्त है। थ्रूपुट में सुधार करने और एक साथ कई जानवरों की छवि बनाने के लिए, कई उपकरणों को एक ही दबाव रेखा से जोड़ा जा सकता है, लेकिन प्रत्येक डिवाइस में एक ही जानवर को नियंत्रित करने वाले अलग-अलग तीन-तरफा कनेक्टर के साथ। डिजाइन उन अध्ययनों के लिए उपयोगी है जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन टाइम-लैप्स छवियों की मांग करते हैं जैसे कि पोस्ट-भ्रूण विकास प्रक्रियाएं, सेल माइग्रेशन, ऑर्गेनेल परिवहन, जीन अभिव्यक्ति अध्ययन, आदि। प्रौद्योगिकी कुछ अनुप्रयोगों जैसे जीवनकाल और उम्र बढ़ने के अध्ययन के लिए सीमित हो सकती है, जिन्हें कई देर से चरण के जानवरों के समानांतर विकास और इमेजिंग की आवश्यकता होती है। पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) इलास्टोमेर का उपयोग इस उपकरण को बनाने के लिए इसकी बायोस्टेबिलिटी26, बायोकम्पैटिबिलिटी27,28, गैस पारगम्यता29,30 और असमर्थ लोचदार मापांक 31 के कारण किया गया था। यह दो-परत उपकरण एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में निरंतर खाद्य आपूर्ति के साथ जानवरों के विकास और नाइट्रोजन गैस का उपयोग करके पीडीएमएस झिल्ली संपीड़न के माध्यम से व्यक्तिगत सी एलिगेंस के फंसने की अनुमति देता है। यह उपकरण पहले प्रकाशित डिवाइस का एक विस्तार है जिसमें निरंतर खाद्य आपूर्ति 3 के तहत माइक्रोचैनल में एक ही जानवर को बढ़ने और इमेजिंग करने का लाभहै। अतिरिक्त अलगाव झिल्ली नेटवर्क और एक 2 मिमी चौड़ी ट्रैपिंग झिल्ली विकासशील जानवरों के कुशल स्थिरीकरण को सक्षम करती है। डिवाइस का उपयोग संवेदी पीवीडी न्यूरॉन्स में न्यूरोनल विकास, वल्वल विकास और डेंड्राइटिक आर्बराइजेशन का निरीक्षण करने के लिए किया गया है। जानवर डिवाइस में प्रतिकूल स्वास्थ्य प्रभावों के बिना बढ़ते हैं और इसके विकास के दौरान एक ही जानवर में इमेजिंग उप-सेलुलर घटनाओं की सुविधा के लिए बार-बार स्थिर किया जा सकता है।
पूरे प्रोटोकॉल को पांच भागों में विभाजित किया गया है। भाग 1 विकास और इमेजिंग चिप के लिए डिवाइस निर्माण का वर्णन करता है। भाग 2 वर्णन करता है कि पीडीएमएस झिल्ली विक्षेपण के लिए एक दबाव प्रणाली कैसे स्थापित की जाए ताकि व्यक्तिगत सी एलिगेंस को स्थिर और अलग किया जा सके। भाग 3 बताता है कि डिवाइस इमेजिंग के लिए नेमाटोड ग्रोथ मीडियम (एनजीएम) प्लेट पर सी एलिगेंस को कैसे सिंक्रनाइज़ किया जाए। भाग 4 बताता है कि डिवाइस में एक जानवर को कैसे लोड किया जाए और कई दिनों तक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के अंदर जानवर को कैसे उगाया जाए। भाग 5 वर्णन करता है कि कई समय बिंदुओं पर एक व्यक्तिगत जानवर को कैसे स्थिर किया जाए, विभिन्न उद्देश्यों का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को कैप्चर किया जाए, और फिजी का उपयोग करके छवियों का विश्लेषण किया जाए।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पेपर में, इसके विकास के दौरान एक एकल जानवर की निरंतर खाद्य आपूर्ति और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ बढ़ते सी एलिगेंस के लिए एक सरल माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के निर्माण और उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डीएसटी – सेंटर फॉर नैनो टेक्नोलॉजी द्वारा समर्थित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए सीआईएफएफ इमेजिंग सुविधा, एनसीबीएस को धन्यवाद देते हैं। एसआर /55 / एनएम -36-2005)। हम डीबीटी (एसपीके), सीएसआईआर-यूजीसी (जेडी), डीएसटी (एसएम), डीबीटी (एसएम), डीएई-प्रिज्म 12-आर एंड डी-आईएमएस-5.02.0202 (एसपीके और गौतम मेनन) द्वारा समर्थित स्पिनिंग डिस्क और एचएचएमआई-आईआईसीएस अनुदान संख्या 55007425 (एसपीके) से अनुसंधान वित्त पोषण का धन्यवाद करते हैं। HB101, PS3239, और WDIS51 उपभेदों को केनोरहाब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (CGC) द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया गया है। एस.पी.के. ने माइक नोनेट की प्रयोगशाला में JSIs609 बनाया।
Materials
| 18 G needles | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | Gauge 18 | |
| 3-way stopcock | Cole-Parmer | WW-30600-02 | Masterflex fitting with luer lock |
| CCD camera | Andor Technology | EMCCD C9100-13no | |
| Circuit board film | Fine Line Imaging, Colorado, USA | The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI) | |
| Convection Oven | Meta-Lab Scientific Industries, India | MSI-5 | |
| Coverslips | Blue stat microscopic cover glass | 22mm x 10Gms | |
| Ethanol | Hi media | ||
| Harris uni-core puncher 1mm | Qiagen | Z708801 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 440191 | |
| Hot plate | IKA | RCT B S 22 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 26895 | |
| KOH | Fisher Scientific | ||
| Laser Scanning Microscope | ZEISS | LSM 5 LIVE | |
| Micropipette tips | Tarsons | 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply | |
| Negative Photoresist-1 | Microchem | SU8-2025 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Negative Photoresist-2 | Microchem | SU8-2050 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Nitrogen gas | Local Supplier | Commercial nitrogen gas | Cylinder volume of 7 cubic meter |
| PDMS (Curing solution) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard curing solution | curing agent |
| Petri plates | Praveen Scientific Corporation | ||
| Plasma cleaner | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-32G | |
| Razor and blades | Lister surgical Blade | ||
| Silicon Elastomer (Base) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard 184 base | elastomer base |
| Silicon tubes | Fisher Scientific | Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm | |
| Silicon wafer | University Wafer, MA, USA | [100] orientation, 4-inch diameter | Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer |
| Spin Coater | SPS-Europe B.V., The Netherlands | SPIN 150 | |
| Spinning Disk microscope | Perkin Elmer ultra-view VOX system | CSU-X1-A3 N | The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package. |
| SU8 developer | Microchem, MA, USA | SU8 Developer | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 448931 | Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic |
| UV lamp | Oriel Instruments, Bangalore, India | 200 Watt and collimated UV light source | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Image analysis |
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