カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ
Summary
このプロトコルは、最大36時間の連続的な食物供給の存在下で C.エレガンス を成長させるために使用される単純なマイクロ流体チップ設計および微細加工方法論を説明しています。成長およびイメージングデバイスは、数日間の開発中の細胞および細胞内プロセスの断続的な長期高解像度イメージングも可能にします。
Abstract
Caenorhabditis elegans(C. elegans) は、発生および細胞生物学的プロセスを研究するための貴重なモデルシステムであることが証明されています。これらの生物学的プロセスを理解するには、多くの場合、同じ動物の長期にわたる繰り返しのイメージングが必要です。寒天パッドで行われる従来の固定化方法に関連する長い回復時間は、動物の健康に悪影響を及ぼし、同じ動物を長期間にわたって繰り返し画像化することは不適切です。この論文では、マイクロ流体チップの設計、製造方法、オンチップ C.エレガンス 培養プロトコル、および個々の動物の発生過程を研究するための長期イメージングの3つの例について説明します。ポリジメチルシロキサンで作製し、カバーガラス上に接着したチップは、窒素ガスを用いて偏向されたエラストマー膜を用いてガラス基板上に動物を固定化する。 C.エレガンス の完全な固定化により、麻酔薬を使用しない方法で細胞および細胞内イベントの堅牢なタイムラプスイメージングが可能になります。大きな断面を有するチャネル形状は、動物が2つの部分的に密封された隔離膜内を自由に動くことを可能にし、連続的な食物供給を伴うチャネル内の成長を可能にする。このシンプルなチップを用いて、PVD感覚ニューロンにおける神経突起の成長、外陰部の発達、樹状突起の樹状突起などの発生現象を、動物がチャネル内で成長するにつれてイメージングすることができます。長期的な成長およびイメージングチップは、単一の圧力ラインで動作し、外部バルブ、安価な流体消耗品がなく、 C.エレガンスを使用する他のラボで簡単に適応できる標準的なワーム処理プロトコルを利用しています。
Introduction
Caenorhabditis elegansは、細胞生物学、老化、発生生物学、および神経生物学を研究するための強力なモデル生物であることが証明されています。その透明な体、短いライフサイクル、容易なメンテナンス、定義された数の細胞、いくつかのヒト遺伝子との相同性、およびよく研究された遺伝学などの利点により、C.エレガンスは基礎生物学の発見と応用研究の両方で人気のあるモデルになりました1,2。個々の動物の繰り返しの長期観察から細胞の生物学的および発生的プロセスを理解することは有益であることがわかります。従来、C.エレガンスは寒天パッド上で麻酔をかけ、顕微鏡下で画像化されていました。動物の健康に対する麻酔薬の悪影響は、同じ動物の長期および反復断続的なイメージングのための麻酔動物の使用を制限します3,4。近年のマイクロ流体技術の進歩と、健康被害が無視できるほどのC.エレガンスの無麻酔トラップへの適応により、同じ動物の短期間および長期間にわたる高解像度イメージングが可能になりました。
マイクロ流体チップは、C. elegans’5ハイスループットスクリーニング6,7,8、トラップおよび分注9、薬物スクリーニング10,11、高解像度イメージングによるニューロン刺激12、および動物の高解像度イメージング12,13,14用に設計されています。スライドに固定化するための超薄型マイクロ流体シートも開発されている15。C.エレガンスの長期研究は、液体培養で成長する動物の低解像度画像を使用して、成長、カルシウム動態、行動に対する薬物の影響を観察して行われています16,17,18,19、それらの寿命、および老化20。シナプスの発達21、ニューロンの再生22、およびミトコンドリアの付加23を評価するために、高解像度顕微鏡を使用した長期的な研究が行われています。細胞の運命および分化の長期高解像度画像化および追跡は、マルチチャネルデバイス24,25で行われている。いくつかの細胞および細胞内イベントは数時間の時間スケールで発生し、in vivoでの細胞動態を理解するためのプロセスのすべての中間ステップを特徴付けるために、発生中の異なる時点で同じ個体をトラップする必要があります。器官形成、神経発生、細胞移動などの生物学的プロセスを画像化するには、動物を複数の時点で同じ方向に固定化する必要があります。我々は以前、ミトコンドリアが触覚受容体ニューロン(TRN)に沿って付加される場所を決定するために、C.エレガンスを36時間以上高解像度イメージングするためのプロトコルを公開しました23。
この論文は、高解像度イメージングを繰り返すためのマイクロフルイディクスベースの方法論を確立するためのプロトコルを提供します。この装置は、単一の流路を有し、装置ごとに1匹の動物の繰り返しイメージングに最適です。スループットを向上させ、一度に多くの動物を画像化するために、複数のデバイスを同じ圧力ラインに接続できますが、各デバイスの1匹の動物を制御する別々の3ウェイコネクタを使用します。このデザインは、胚発生後の発生過程、細胞移動、オルガネラ輸送、遺伝子発現研究など、高解像度のタイムラプス画像を必要とする研究に役立ちます。この技術は、多くの後期動物の並行成長とイメージングを必要とする寿命や老化の研究など、一部のアプリケーションに制限される可能性があります。ポリジメチルシロキサン(PDMS)エラストマーは、その生物学的安定性26、生体適合性27,28、気体透過性29,30、および調整可能な弾性率31のために、このデバイスの製造に使用されました。この2層装置は、マイクロ流体チャネルでの連続的な食物供給と、窒素ガスを使用したPDMS膜圧縮による個々のC.エレガンスの捕獲により、動物の成長を可能にします。この装置は、連続的な食物供給3の下でマイクロチャネル内で同じ動物を成長および画像化できるという利点を有する以前に公開された装置の拡張である。追加の分離膜ネットワークと2mm幅のトラップ膜により、発育中の動物の効率的な固定化が可能になります。このデバイスは、感覚PVDニューロンのニューロンの発達、外陰部の発達、および樹状突起の樹木形成を観察するために使用されています。動物は、デバイス内で健康に悪影響を与えることなく成長し、その発生中に同じ動物における細胞内イベントのイメージングを容易にするために繰り返し固定化することができる。
プロトコル全体は5つの部分に分かれています。パート1では、成長およびイメージングチップのデバイス製造について説明します。パート2では、PDMS膜たわみの圧力システムを設定して、個々の C.エレガンスを固定化して分離する方法について説明します。パート3では、デバイスイメージングのために線虫増殖培地(NGM)プレート上で C.エレガンス を同期させる方法について説明します。パート4では、1匹の動物をデバイスにロードし、マイクロ流体デバイス内で数日間動物を成長させる方法について説明します。パート5では、複数の時点で個々の動物を固定し、さまざまな対物レンズを使用して高解像度の画像をキャプチャし、フィジーを使用して画像を分析したりする方法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この論文では、成長中の単一の動物の一定の食物供給と高解像度イメージングを備えた C.エレガンス を成長させるための単純なマイクロ流体デバイスの製造と使用のためのプロトコルが説明されています。この製造プロセスは簡単で、非滅菌環境で行うことができます。製造段階では、ほこりのない環境が重要です。ダスト粒子の存在は、2つの結合面間の不適切な接触につながり、 <…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、CIFFイメージング施設、NCBSがDST-ナノテクノロジーセンター(No.SR / 55 / NM-36-2005)。DBT (SPK)、CSIR-UGC (JD)、DST (SM)、DBT (SM)、DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK and Gautam Menon) が支援するスピニングディスク、および HHMI-IECS grant number 55007425 (SPK) からの研究資金に感謝する。HB101、 PS3239、および wdIs51 株は、NIH研究インフラストラクチャプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されている Caenorhabditis 遺伝学センター(CGC)によって提供されました。S.P.K.はマイク・ノネットの研究室で jsIs609 を製作しました。
Materials
| 18 G needles | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | Gauge 18 | |
| 3-way stopcock | Cole-Parmer | WW-30600-02 | Masterflex fitting with luer lock |
| CCD camera | Andor Technology | EMCCD C9100-13no | |
| Circuit board film | Fine Line Imaging, Colorado, USA | The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI) | |
| Convection Oven | Meta-Lab Scientific Industries, India | MSI-5 | |
| Coverslips | Blue stat microscopic cover glass | 22mm x 10Gms | |
| Ethanol | Hi media | ||
| Harris uni-core puncher 1mm | Qiagen | Z708801 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 440191 | |
| Hot plate | IKA | RCT B S 22 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 26895 | |
| KOH | Fisher Scientific | ||
| Laser Scanning Microscope | ZEISS | LSM 5 LIVE | |
| Micropipette tips | Tarsons | 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply | |
| Negative Photoresist-1 | Microchem | SU8-2025 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Negative Photoresist-2 | Microchem | SU8-2050 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Nitrogen gas | Local Supplier | Commercial nitrogen gas | Cylinder volume of 7 cubic meter |
| PDMS (Curing solution) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard curing solution | curing agent |
| Petri plates | Praveen Scientific Corporation | ||
| Plasma cleaner | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-32G | |
| Razor and blades | Lister surgical Blade | ||
| Silicon Elastomer (Base) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard 184 base | elastomer base |
| Silicon tubes | Fisher Scientific | Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm | |
| Silicon wafer | University Wafer, MA, USA | [100] orientation, 4-inch diameter | Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer |
| Spin Coater | SPS-Europe B.V., The Netherlands | SPIN 150 | |
| Spinning Disk microscope | Perkin Elmer ultra-view VOX system | CSU-X1-A3 N | The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package. |
| SU8 developer | Microchem, MA, USA | SU8 Developer | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 448931 | Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic |
| UV lamp | Oriel Instruments, Bangalore, India | 200 Watt and collimated UV light source | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Image analysis |
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