Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩
Summary
이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) 는 발달 및 세포 생물학적 과정을 연구하기위한 귀중한 모델 시스템임이 입증되었습니다. 이러한 생물학적 과정을 이해하려면 종종 동일한 동물의 장기적이고 반복적 인 이미징이 필요합니다. 한천 패드에서 수행되는 기존의 고정 방법과 관련된 긴 회복 시간은 동물 건강에 해로운 영향을 미치므로 장기간에 걸쳐 동일한 동물을 반복적으로 이미지화하는 것은 부적절합니다. 이 논문은 미세 유체 칩 설계, 제조 방법, 온칩 C. elegans 배양 프로토콜 및 개별 동물의 발달 과정을 연구하기위한 장기 이미징의 세 가지 예를 설명합니다. 폴리 디메틸 실록산으로 제작되고 커버 유리에 접착 된이 칩은 질소 가스를 사용하여 편향되는 엘라스토머 멤브레인을 사용하여 유리 기판에 동물을 고정시킵니다. C. elegans 의 완전한 고정화는 마취 없는 방식으로 세포 및 하위 세포 이벤트의 강력한 타임 랩스 이미징을 가능하게 합니다. 단면이 큰 채널 형상을 통해 동물은 부분적으로 밀봉 된 두 개의 격리 막 내에서 자유롭게 움직일 수있어 지속적인 먹이 공급으로 채널에서 성장할 수 있습니다. 이 간단한 칩을 사용하여 동물이 채널 내부에서 성장함에 따라 PVD 감각 뉴런의 신경 과정 성장, 외음부 발달 및 수지상 수목 화와 같은 발달 현상의 이미징을 수행 할 수 있습니다. 장기 성장 및 이미징 칩은 단일 압력 라인, 외부 밸브 없음, 저렴한 유체 소모품으로 작동하며 C. elegans를 사용하는 다른 실험실에서 쉽게 적용할 수 있는 표준 웜 처리 프로토콜을 활용합니다.
Introduction
Caenorhabditis elegans는 세포 생물학, 노화, 발달 생물학 및 신경 생물학을 연구하는 강력한 모델 유기체임이 입증되었습니다. 투명한 몸체, 짧은 수명주기, 쉬운 유지 관리, 정의 된 수의 세포, 여러 인간 유전자와의 상 동성 및 잘 연구 된 유전학과 같은 장점으로 인해 C. elegans는 기초 생물학 발견과 응용 연구 1,2 모두에서 인기있는 모델이되었습니다. 개별 동물에 대한 반복적 인 장기 관찰을 통해 세포의 생물학적 및 발달 과정을 이해하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 통상적으로, C. elegans는 한천 패드에 마취되고 현미경으로 이미지화된다. 동물의 건강에 대한 마취제의 부작용은 동일한 동물의 장기간 및 반복 간헐적 인 영상에 마취 된 동물의 사용을 제한합니다 3,4. 최근 미세 유체 기술의 발전과 건강 위험이 무시할 수있는 C. elegans의 마취없는 포획에 대한 적응은 단기간에 걸쳐 동일한 동물의 고해상도 이미징을 가능하게합니다.
미세 유체 칩은 C. elegans’5 고 처리량 스크리닝 6,7,8, 트래핑 및 분배9, 약물 스크리닝 10,11, 고해상도 이미징 12 및 동물의 고해상도 이미징12,13,14을 위해 설계되었습니다. 슬라이드 상의 고정화를 위한 초박형 마이크로유체 시트가 또한 개발되었다(15). C. elegans에 대한 장기 연구는 성장, 칼슘 역학, 행동에 대한 약물 효과16,17,18,19, 수명및 노화 20를 관찰하기 위해 액체 배양에서 자라는 동물의 저해상도 이미지를 사용하여 수행되었습니다. 고분해능 현미경을 사용한 장기 연구는 시냅스 발달21, 뉴런 재생22 및 미토콘드리아 추가23을 평가하기 위해 수행되었습니다. 세포 운명 및 분화의 장기 고해상도 이미징 및 추적은 다중 채널 장치24,25에서 수행되었습니다. 여러 세포 및 하위 세포 사건은 몇 시간의 시간 규모에 걸쳐 발생하며 생체 내 세포 역학을 이해하기 위해 프로세스의 모든 중간 단계를 특성화하기 위해 발달 중 다른 시점에서 동일한 개체를 포획해야 합니다. 기관 형성, 신경 발달 및 세포 이동과 같은 생물학적 과정을 이미지화하려면 동물이 여러 시점에서 동일한 방향으로 고정되어야 합니다. 우리는 이전에 터치 수용체 뉴런(TRN)23을 따라 미토콘드리아가 추가되는 위치를 결정하기 위해 36시간 이상 동안 C. elegans의 고해상도 이미징을 위한 프로토콜을 발표했습니다.
이 논문은 반복적인 고해상도 이미징을 위한 미세유체공학 기반 방법론을 확립하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 단일 흐름 채널이 있는 이 장치는 장치당 단일 동물의 반복 이미징에 가장 적합합니다. 처리량을 개선하고 한 번에 많은 동물을 이미지화하기 위해 여러 장치를 동일한 압력 라인에 연결할 수 있지만 각 장치에서 단일 동물을 제어하는 별도의 3방향 커넥터를 사용할 수 있습니다. 이 디자인은 배아 후 발달 과정, 세포 이동, 세포 소기관 수송, 유전자 발현 연구 등과 같은 고해상도 타임랩스 이미지를 요구하는 연구에 유용합니다. 이 기술은 많은 후기 단계의 동물의 병렬 성장 및 이미징이 필요한 수명 및 노화 연구와 같은 일부 응용 분야에서 제한 될 수 있습니다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 엘라스토머는 생체 안정성26, 생체 적합성 27,28, 가스 투과성 29,30 및 조정 가능한 탄성 계수 31로 인해이 장치를 제조하는 데 사용되었습니다. 이 2 층 장치는 미세 유체 채널에서 지속적인 먹이 공급으로 동물의 성장과 질소 가스를 사용한 PDMS 막 압축을 통해 개별 C. elegans의 포획을 허용합니다. 이 장치는 연속적인 식품 공급 하에서 마이크로 채널에서 동일한 동물을 성장시키고 이미징하는 이점을 가진 이전에 공개 된 장치의 확장입니다3. 추가 격리막 네트워크와 2mm 너비의 포획 멤브레인은 발달 중인 동물을 효율적으로 고정할 수 있습니다. 이 장치는 감각 PVD 뉴런에서 신경 발달, 외음부 발달 및 수지상 수목 수목을 관찰하는 데 사용되었습니다. 동물은 장치에서 건강에 악영향을 미치지 않고 성장하며 발달 중에 동일한 동물에서 이미징 하위 세포 이벤트를 용이하게하기 위해 반복적으로 고정 될 수 있습니다.
전체 프로토콜은 다섯 부분으로 나뉩니다. 파트 1에서는 성장 및 이미징 칩의 장치 제작에 대해 설명합니다. 파트 2에서는 개별 C. elegans를 고정하고 분리하기 위해 PDMS 멤브레인 편향에 대한 압력 시스템을 설정하는 방법을 설명합니다. 3부에서는 장치 이미징을 위해 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에서 C. elegans를 동기화하는 방법을 설명합니다. 파트 4는 장치에 단일 동물을 로딩하고 며칠 동안 미세 유체 장치 내부에서 동물을 성장시키는 방법을 설명합니다. 5부에서는 여러 시점에서 개별 동물을 고정하고, 다양한 대물렌즈를 사용하여 고해상도 이미지를 캡처하고, 피지를 사용하여 이미지를 분석하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에서는 개발 과정에서 단일 동물의 지속적인 식량 공급과 고해상도 이미징으로 C. elegans 를 성장시키기위한 간단한 미세 유체 장치의 제조 및 사용을위한 프로토콜이 설명되었습니다. 이 제조 공정은 간단하며 비멸균 환경에서 수행할 수 있습니다. 먼지가 없는 환경은 제조 단계에서 매우 중요합니다. 먼지 입자가 있으면 두 접합 표면 사이에 부적절한 접촉이 발생하여 C. elegans</e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 CIFF 이미징 시설, NCBS가 DST – 나노 기술 센터에서 지원하는 컨포칼 현미경을 사용해 주셔서 감사합니다. SR/55/NM-36-2005). DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK 및 Gautam Menon)가 지원하는 스피닝 디스크, HHMI-IECS 보조금 번호 55007425 (SPK)의 연구 자금에 감사드립니다. HB101, PS3239 및 wdIs51 균주는 NIH 연구 인프라 프로그램 사무소 (P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)에서 제공했습니다. SPK는 Mike Nonet의 실험실에서 jsIs609 를 만들었습니다.
Materials
| 18 G needles | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | Gauge 18 | |
| 3-way stopcock | Cole-Parmer | WW-30600-02 | Masterflex fitting with luer lock |
| CCD camera | Andor Technology | EMCCD C9100-13no | |
| Circuit board film | Fine Line Imaging, Colorado, USA | The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI) | |
| Convection Oven | Meta-Lab Scientific Industries, India | MSI-5 | |
| Coverslips | Blue stat microscopic cover glass | 22mm x 10Gms | |
| Ethanol | Hi media | ||
| Harris uni-core puncher 1mm | Qiagen | Z708801 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 440191 | |
| Hot plate | IKA | RCT B S 22 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 26895 | |
| KOH | Fisher Scientific | ||
| Laser Scanning Microscope | ZEISS | LSM 5 LIVE | |
| Micropipette tips | Tarsons | 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply | |
| Negative Photoresist-1 | Microchem | SU8-2025 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Negative Photoresist-2 | Microchem | SU8-2050 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Nitrogen gas | Local Supplier | Commercial nitrogen gas | Cylinder volume of 7 cubic meter |
| PDMS (Curing solution) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard curing solution | curing agent |
| Petri plates | Praveen Scientific Corporation | ||
| Plasma cleaner | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-32G | |
| Razor and blades | Lister surgical Blade | ||
| Silicon Elastomer (Base) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard 184 base | elastomer base |
| Silicon tubes | Fisher Scientific | Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm | |
| Silicon wafer | University Wafer, MA, USA | [100] orientation, 4-inch diameter | Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer |
| Spin Coater | SPS-Europe B.V., The Netherlands | SPIN 150 | |
| Spinning Disk microscope | Perkin Elmer ultra-view VOX system | CSU-X1-A3 N | The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package. |
| SU8 developer | Microchem, MA, USA | SU8 Developer | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 448931 | Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic |
| UV lamp | Oriel Instruments, Bangalore, India | 200 Watt and collimated UV light source | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Image analysis |
Referências
- Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
- Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), 372-385 (2011).
- Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
- Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
- Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
- Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
- Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
- Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
- Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
- Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
- Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, 159-179 (2015).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
- Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
- Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
- Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
- Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
- Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, 203-209 (2002).
- Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Biologia do Desenvolvimento. 345 (1), 18-33 (2010).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), 1285-1288 (2010).
- Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
- Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
- Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
- Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
- Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).
