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Bioengenharia

Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

Published: April 11, 2022
doi:
10.3791/63136
, ,
1National Centre for Biological Sciences,TIFR, 2Department of Biological Sciences,TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering,The University of Texas at Austin

Summary

O protocolo descreve um projeto de chip microfluídico simples e metodologia de microfabricação usada para cultivar C. elegans na presença de um suprimento contínuo de alimentos por até 36 h. O dispositivo de crescimento e imagem também permite imagens intermitentes de alta resolução a longo prazo de processos celulares e subcelulares durante o desenvolvimento por vários dias.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) provou ser um valioso sistema modelo para o estudo de processos biológicos de desenvolvimento e celular. Compreender esses processos biológicos geralmente requer imagens de longo prazo e repetidas do mesmo animal. Longos tempos de recuperação associados a métodos convencionais de imobilização feitos em almofadas de ágar têm efeitos prejudiciais sobre a saúde animal, tornando inadequado fotografar repetidamente o mesmo animal por longos períodos de tempo. Este artigo descreve um projeto de chip microfluídico, método de fabricação, protocolo de cultivo de C. elegans em chip e três exemplos de imagens de longo prazo para estudar processos de desenvolvimento em animais individuais. O chip, fabricado com polidimetilsiloxano e ligado em um vidro de cobertura, imobiliza os animais em um substrato de vidro usando uma membrana elastomérica que é desviada usando gás nitrogênio. A imobilização completa de C. elegans permite imagens robustas de lapso de tempo de eventos celulares e subcelulares de maneira livre de anestésico. Uma geometria do canal com uma grande seção transversal permite que o animal se mova livremente dentro de duas membranas de isolamento parcialmente seladas, permitindo o crescimento no canal com um suprimento contínuo de alimentos. Usando este chip simples, a imagem de fenômenos de desenvolvimento, como o crescimento do processo neuronal, o desenvolvimento vulvar e a arborização dendrítica nos neurônios sensoriais PVD, à medida que o animal cresce dentro do canal, pode ser realizada. O chip de crescimento e imagem a longo prazo opera com uma única linha de pressão, sem válvulas externas, consumíveis fluídicos baratos e utiliza protocolos padrão de manuseio de vermes que podem ser facilmente adaptados por outros laboratórios usando C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans provou ser um poderoso organismo modelo para estudar biologia celular, envelhecimento, biologia do desenvolvimento e neurobiologia. Vantagens como seu corpo transparente, ciclo de vida curto, fácil manutenção, número definido de células, homologia com vários genes humanos e genética bem estudada levaram C. elegans a se tornar um modelo popular tanto para descobertas de biologia fundamental quanto para pesquisas aplicadas 1,2. Compreender os processos biológicos e de desenvolvimento das células a partir de repetidas observações a longo prazo de animais individuais pode revelar-se benéfico. Convencionalmente, C. elegans é anestesiado em almofadas de ágar e fotografado ao microscópio. Os efeitos adversos dos anestésicos sobre a saúde dos animais limitam o uso de animais anestesiados para imagens intermitentes prolongadas e repetidas do mesmo animal 3,4. Avanços recentes em tecnologias microfluídicas e sua adaptação para aprisionamento sem anestesia de C. elegans com riscos insignificantes para a saúde permitem imagens de alta resolução do mesmo animal em um curto e longo período de tempo.

Os chips microfluídicos foram projetados para triagem de alto rendimento de C. elegans’5 6,7,8, aprisionamento e dispensação9, triagem de drogas10,11, estimulação de neurônios com imagens de alta resolução 12 e imagens de alta resolução do animal12,13,14. Folhas microfluídicas ultrafinas para imobilização em lâminas também foram desenvolvidas15. Estudos de longo prazo de C. elegans têm sido realizados utilizando imagens de baixa resolução de animais crescendo em cultura líquida para observar crescimento, dinâmica de cálcio, efeitos de drogas sobre seu comportamento16,17,18,19, sua longevidade e envelhecimento20. Estudos de longo prazo utilizando microscopia de alta resolução têm sido realizados para avaliar o desenvolvimento sináptico21, a regeneração neuronal22 e a adição mitocondrial23. Imagens de alta resolução de longo prazo e rastreamento do destino celular e diferenciação têm sido realizados em dispositivos multicanais24,25. Vários eventos celulares e subcelulares ocorrem ao longo das escalas de tempo de várias horas e requerem aprisionar o mesmo indivíduo em diferentes pontos de tempo durante o seu desenvolvimento para caracterizar todas as etapas intermediárias do processo para entender a dinâmica celular in vivo. Para visualizar processos biológicos, como organogênese, desenvolvimento neuronal e migração celular, o animal precisa ser imobilizado na mesma orientação em vários pontos de tempo. Publicamos anteriormente um protocolo para imagens de alta resolução de C. elegans por mais de 36 h para determinar onde as mitocôndrias são adicionadas ao longo dos neurônios receptores de toque (TRNs)23.

Este artigo fornece um protocolo para estabelecer uma metodologia baseada em microfluídica para imagens repetidas de alta resolução. Este dispositivo, com um único canal de fluxo, é mais adequado para imagens repetidas de um único animal por dispositivo. Para melhorar a produtividade e a imagem de muitos animais de uma só vez, vários dispositivos podem ser conectados à mesma linha de pressão, mas com conectores de três vias separados, controlando um único animal em cada dispositivo. O design é útil para estudos que exigem imagens de lapso de tempo de alta resolução, como processos de desenvolvimento pós-embrionários, migração celular, transporte de organelas, estudos de expressão gênica, etc. A tecnologia pode ser limitante para algumas aplicações, como estudos de tempo de vida e envelhecimento, que exigem crescimento paralelo e imagens de muitos animais em estágio avançado. O elastômero polidimetilsiloxano (PDMS) foi utilizado para a fabricação deste dispositivo devido à sua bioestabilidade26, biocompatibilidade 27,28, permeablilidade gasosa 29,30 e módulo elástico ajustável 31. Este dispositivo de duas camadas permite o crescimento de animais com suprimento contínuo de alimentos em um canal microfluídico e o aprisionamento de C. elegans individuais via compressão de membrana PDMS usando gás nitrogênio. Este dispositivo é uma extensão do dispositivo publicado anteriormente com a vantagem de cultivar e fotografar o mesmo animal no microcanal sob um suprimento contínuo de alimentos3. A rede de membrana de isolamento adicional e uma membrana de aprisionamento de 2 mm de largura permitem a imobilização eficiente de animais em desenvolvimento. O dispositivo tem sido usado para observar o desenvolvimento neuronal, o desenvolvimento vulvar e a arborização dendrítica em neurônios sensoriais PVD. Os animais crescem sem efeitos adversos à saúde no dispositivo e podem ser repetidamente imobilizados para facilitar a imagem de eventos subcelulares no mesmo animal durante o seu desenvolvimento.

Todo o protocolo é dividido em cinco partes. A Parte 1 descreve a fabricação do dispositivo para o chip de crescimento e imagem. A Parte 2 descreve como configurar um sistema de pressão para a deflexão da membrana PDMS para imobilizar e isolar C. elegans individuais. A Parte 3 descreve como sincronizar C. elegans em uma placa de meio de crescimento de nematoides (NGM) para imagens de dispositivos. A Parte 4 descreve como carregar um único animal no dispositivo e cultivar o animal dentro do dispositivo microfluídico por vários dias. A Parte 5 descreve como imobilizar um animal individual em vários pontos de tempo, capturar imagens de alta resolução usando diferentes objetivos e analisar as imagens usando Fiji.

Protocol

1. Fabricação de crescimento e dispositivo de imagem Fabricação de moldes SU8Projete os padrões 1 (camada de fluxo) e 2 (camada de controle) usando formas retangulares em um software de processamento de texto (ou um software CAD de projeto auxiliado por computador) e imprima as fotomáscaras com a ajuda de um plotter a laser com um tamanho mínimo de recurso de 8 μm em filme à base de poliéster (Figura 1). Corte as bolachas de silício em…

Representative Results

Caracterização do dispositivo: O dispositivo de crescimento e imagem consiste em duas camadas PDMS unidas (Figura 1) usando ligação de plasma irreversível. A camada de fluxo (padrão 1) que tem 10 mm de comprimento e 40 μm ou 80 μm de altura nos permite cultivar o animal em cultura líquida (Figura 1A). A camada de aprisionamento (padrão 2) possui uma membrana de 2 mm de largura (Figura 1B) para imobilizaç…

Discussion

Neste trabalho, um protocolo para fabricação e uso de um dispositivo microfluídico simples para o cultivo de C. elegans com suprimento constante de alimentos e imagens de alta resolução de um único animal durante seu desenvolvimento foi descrito. Este processo de fabricação é simples e pode ser feito em um ambiente não estéril. Um ambiente livre de poeira é fundamental durante as etapas de fabricação. A presença de partículas de poeira levaria ao contato inadequado entre as duas superfícies de l…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos à instalação de imagem CIFF, NCBS pelo uso dos microscópios confocais apoiados pelo DST – Centre for Nanotechnology (No. SR/55/NM-36-2005). Agradecemos o financiamento de pesquisa do DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), disco giratório suportado pelo DAE-PRISM 12-R & D-IMS-5.02.0202 (SPK e Gautam Menon) e HHMI-IECS número de concessão 55007425 (SPK). As cepas HB101, PS3239 e wdIs51 foram fornecidas pelo Caenorhabditis Genetics Center (CGC), que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). S.P.K. fez jsIs609 no laboratório de Mike Nonet.

Materials

18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis
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Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).
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