Ett enkelt mikrofluidiskt chip för långsiktig tillväxt och avbildning av Caenorhabditis elegans

Summary

Protokollet beskriver en enkel mikrofluidisk chipdesign och mikrofabrikationsmetodik som används för att odla C. elegans i närvaro av en kontinuerlig livsmedelsförsörjning i upp till 36 timmar. Tillväxt- och bildbehandlingsenheten möjliggör också intermittent långsiktig högupplöst avbildning av cellulära och subcellulära processer under utveckling i flera dagar.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) har visat sig vara ett värdefullt modellsystem för att studera utvecklings- och cellbiologiska processer. Att förstå dessa biologiska processer kräver ofta långvarig och upprepad avbildning av samma djur. Långa återhämtningstider i samband med konventionella immobiliseringsmetoder gjorda på agarkuddar har skadliga effekter på djurhälsan vilket gör det olämpligt att upprepade gånger avbilda samma djur under långa tidsperioder. Detta papper beskriver en mikrofluidisk chipdesign, tillverkningsmetod, on-chip C. elegans odlingsprotokoll och tre exempel på långsiktig avbildning för att studera utvecklingsprocesser hos enskilda djur. Chipet, tillverkat med polydimetylsiloxan och bundet på ett täckglas, immobiliserar djur på ett glassubstrat med hjälp av ett elastomermembran som avböjs med hjälp av kvävgas. Fullständig immobilisering av C. elegans möjliggör robust time-lapse-avbildning av cellulära och subcellulära händelser på ett bedövningsfritt sätt. En kanalgeometri med ett stort tvärsnitt gör det möjligt för djuret att röra sig fritt inom två delvis förseglade isoleringsmembran som möjliggör tillväxt i kanalen med kontinuerlig mattillförsel. Med hjälp av detta enkla chip kan avbildning av utvecklingsfenomen som neuronal processtillväxt, vulvalutveckling och dendritisk arborisering i PVD-sensoriska neuroner, när djuret växer inuti kanalen, utföras. Det långsiktiga tillväxt- och bildchipet arbetar med en enda tryckledning, inga externa ventiler, billiga flytande förbrukningsvaror och använder standardprotokoll för maskhantering som enkelt kan anpassas av andra laboratorier som använder C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans har visat sig vara en kraftfull modellorganism för att studera cellbiologi, åldrande, utvecklingsbiologi och neurobiologi. Fördelar som dess transparenta kropp, korta livscykel, enkelt underhåll, ett definierat antal celler, homologi med flera mänskliga gener och välstuderad genetik har lett till att C. elegans blivit en populär modell både för grundläggande biologiska upptäckter och tillämpad forskning ^1,2. Att förstå cellens biologiska och utvecklingsprocesser från upprepad långtidsobservation av enskilda djur kan visa sig vara fördelaktigt. Konventionellt bedövas C. elegans på agarkuddar och avbildas under mikroskopet. Negativa effekter av anestetika på djurens hälsa begränsar användningen av bedövade djur för långvarig och upprepad intermittent avbildning av samma djur ^3,4. De senaste framstegen inom mikrofluidisk teknik och deras anpassning för anestesifri fångst av C. elegans med försumbara hälsorisker möjliggör högupplöst avbildning av samma djur under en kort och lång tidsperiod.

Mikrofluidiska chips har utformats för C. elegans’5 high throughput screening 6,7,8, trapping and dispensing⁹, drug screening 10,11, neuronstimulering med högupplöst avbildning 12 och högupplöst avbildning av djuret ^12,13,14. Ultratunna mikrofluidiska ark för immobilisering på glidbanor har också utvecklats¹⁵. Långtidsstudier av C. elegans har utförts med hjälp av lågupplösta bilder av djur som växer i flytande kultur för att observera tillväxt, kalciumdynamik, läkemedelseffekter på deras beteende^16,17,18,19, deras livslängd och åldrande²⁰. Långtidsstudier med högupplöst mikroskopi har utförts för att bedöma synaptisk utveckling²¹, neuronal regenerering 22 och mitokondriell addition²³. Långvarig högupplöst avbildning och spårning av cellöde och differentiering har gjorts i flerkanaliga enheter^24,25. Flera cellulära och subcellulära händelser inträffar under tidsskalorna på flera timmar och kräver att samma individ fångas vid olika tidpunkter under deras utveckling för att karakterisera alla mellanliggande steg i processen för att förstå cellulär dynamik in vivo. För att avbilda biologisk process som organogenes, neuronal utveckling och cellmigration måste djuret immobiliseras i samma riktning vid flera tidpunkter. Vi har tidigare publicerat ett protokoll för högupplöst avbildning av C. elegans i över 36 timmar för att bestämma var mitokondrier tillsätts längs beröringsreceptorneuronerna (TRN)²³.

Detta dokument tillhandahåller ett protokoll för att upprätta en mikrofluidikbaserad metod för upprepad högupplöst avbildning. Denna enhet, med en enda flödeskanal, passar bäst för upprepad avbildning av ett enda djur per enhet. För att förbättra genomströmningen och avbilda många djur samtidigt kan flera enheter anslutas till samma tryckledning men med separata trevägskontakter som styr ett enda djur i varje enhet. Designen är användbar för studier som kräver högupplösta time-lapse-bilder som post-embryonala utvecklingsprocesser, cellmigration, organelltransport, genuttrycksstudier etc. Tekniken kan vara begränsande för vissa applikationer som livslängds- och åldrandestudier som kräver parallell tillväxt och avbildning av många djur i sent stadium. Polydimetylsiloxan (PDMS) elastomer användes för att tillverka denna anordning på grund av dess biostabilitet²⁶, biokompatibilitet 27,28, gaspermeablilitet ^29,30 och avstämbar elastisk modul ³¹. Denna tvåskiktsanordning möjliggör tillväxt av djur med kontinuerlig matförsörjning i en mikrofluidisk kanal och fångst av enskilda C. elegans via PDMS-membrankompression med användning av kvävgas. Denna enhet är en förlängning av den tidigare publicerade enheten med fördelen att odla och avbilda samma djur i mikrokanalen under en kontinuerlig matförsörjning³. Det extra isoleringsmembrannätverket och ett 2 mm brett fångstmembran möjliggör effektiv immobilisering av utvecklande djur. Enheten har använts för att observera neuronal utveckling, vulvalutveckling och dendritisk arborisering i sensoriska PVD-neuroner. Djuren växer utan negativa hälsoeffekter i enheten och kan upprepas immobiliseras för att underlätta avbildning av subcellulära händelser hos samma djur under dess utveckling.

Hela protokollet är uppdelat i fem delar. Del 1 beskriver enhetstillverkning för tillväxt- och bildchipet. Del 2 beskriver hur man ställer in ett trycksystem för PDMS-membranavböjning för att immobilisera och isolera enskilda C. elegans. Del 3 beskriver hur man synkroniserar C. elegans på en nematodtillväxtmedium (NGM) platta för avbildning av enheter. Del 4 beskriver hur man laddar ett enda djur i enheten och odlar djuret inuti mikrofluidikanordningen i flera dagar. Del 5 beskriver hur man immobiliserar ett enskilt djur vid flera tidpunkter, tar högupplösta bilder med olika mål och analyserar bilderna med Fiji.

Protocol

1. Tillverkning av tillväxt- och bildåtergivningsapparat SU8 mögel tillverkningDesigna mönster 1 (flödeslager) och 2 (kontrollskikt) med rektangulära former i ett ordbehandlingsprogram (eller ett datorstödd design-CAD-programvara) och skriv ut fotomaskerna med hjälp av en laserplotter med en minsta funktionsstorlek på 8 μm på polyesterbaserad film (figur 1). Skär kiselskivor i 2,5 cm × 2,5 cm bitar och rengör dem med 20% KOH i 1 min…

Representative Results

Karakterisering av enheten: Tillväxt- och avbildningsanordningen består av två PDMS-lager bundna ihop (figur 1) med irreversibel plasmabindning. Flödesskiktet (mönster 1) som är 10 mm långt och 40 μm eller 80 μm i höjd gör att vi kan odla djuret i flytande kultur (Figur 1A). Fångstskiktet (mönster 2) har ett 2 mm brett membran (figur 1B) för immobilisering av djuret för högupplöst avbildning. Maske…

Discussion

I detta dokument beskrivs ett protokoll för tillverkning och användning av en enkel mikrofluidisk anordning för odling av C. elegans med konstant matförsörjning och högupplöst avbildning av ett enda djur under dess utveckling. Denna tillverkningsprocess är enkel och kan göras i en icke-steril miljö. En dammfri miljö är avgörande under tillverkningsstegen. Närvaron av dammpartiklar skulle leda till felaktig kontakt mellan de två bindningsytorna, vilket resulterar i dålig bindning och läckage av e…

Materials

18 G needles	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	Gauge 18
3-way stopcock	Cole-Parmer	WW-30600-02	Masterflex fitting with luer lock
CCD camera	Andor Technology	EMCCD C9100-13no
Circuit board film	Fine Line Imaging, Colorado, USA		The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven	Meta-Lab Scientific Industries, India	MSI-5
Coverslips	Blue stat microscopic cover glass		22mm x 10Gms
Ethanol	Hi media
Harris uni-core puncher 1mm	Qiagen	Z708801
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	440191
Hot plate	IKA	RCT B S 22
Isopropanol	Fisher Scientific	26895
KOH	Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope	ZEISS	LSM 5 LIVE
Micropipette tips	Tarsons		0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1	Microchem	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2	Microchem	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas	Local Supplier	Commercial nitrogen gas	Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard curing solution	curing agent
Petri plates	Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-32G
Razor and blades	Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard 184 base	elastomer base
Silicon tubes	Fisher Scientific		Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer	University Wafer, MA, USA	[100] orientation, 4-inch diameter	Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater	SPS-Europe B.V., The Netherlands	SPIN 150
Spinning Disk microscope	Perkin Elmer ultra-view VOX system	CSU-X1-A3 N	The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer	Microchem, MA, USA	SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	448931	Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp	Oriel Instruments, Bangalore, India		200 Watt and collimated UV light source
Volocity software	Perkin-Elmer		Image analysis