Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip
Summary
Protokol, 36 saate kadar sürekli bir gıda arzı varlığında C. elegans yetiştirmek için kullanılan basit bir mikroakışkan çip tasarımını ve mikrofabrikasyon metodolojisini açıklamaktadır. Büyüme ve görüntüleme cihazı ayrıca, birkaç gün boyunca geliştirme sırasında hücresel ve hücre altı süreçlerin aralıklı uzun süreli yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), gelişimsel ve hücre biyolojik süreçlerini incelemek için değerli bir model sistem olduğunu kanıtlamıştır. Bu biyolojik süreçleri anlamak genellikle aynı hayvanın uzun süreli ve tekrarlanan görüntülenmesini gerektirir. Agar pedleri üzerinde yapılan geleneksel immobilizasyon yöntemleriyle ilişkili uzun iyileşme süreleri, hayvan sağlığı üzerinde zararlı etkilere sahiptir ve aynı hayvanı uzun süre boyunca tekrar tekrar görüntülemeyi uygun hale getirmez. Bu yazıda mikroakışkan çip tasarımı, üretim yöntemi, çip üzerinde C. elegans kültürleme protokolü ve bireysel hayvanlarda gelişimsel süreçleri incelemek için üç uzun vadeli görüntüleme örneği açıklanmaktadır. Polidimetilsiloksan ile imal edilen ve bir kapak camına bağlanan çip, azot gazı kullanılarak saptırılan elastomerik bir membran kullanarak hayvanları bir cam substrat üzerinde hareketsiz hale getirir. C. elegans’ın tamamen immobilizasyonu, hücresel ve hücre altı olayların anesteziz bir şekilde sağlam bir hızlandırılmış görüntülenmesini sağlar. Büyük bir kesitli bir kanal geometrisi, hayvanın kısmen kapatılmış iki izolasyon membranı içinde serbestçe hareket etmesini sağlayarak sürekli bir gıda kaynağı ile kanalda büyümeye izin verir. Bu basit çipi kullanarak, hayvan kanalın içinde büyüdükçe, PVD duyusal nöronlarında nöronal süreç büyümesi, vulval gelişim ve dendritik arborizasyon gibi gelişimsel olayların görüntülenmesi gerçekleştirilebilir. Uzun vadeli büyüme ve görüntüleme çipi, tek bir basınç hattı ile çalışır, harici valf içermez, ucuz akışkan sarf malzemeleri kullanır ve C. elegans kullanan diğer laboratuvarlar tarafından kolayca uyarlanabilen standart sonsuz taşıma protokollerini kullanır.
Introduction
Caenorhabditis elegans, hücre biyolojisini, yaşlanmayı, gelişim biyolojisini ve nörobiyolojiyi incelemek için güçlü bir model organizma olduğunu kanıtlamıştır. Şeffaf gövdesi, kısa yaşam döngüsü, kolay bakımı, tanımlanmış sayıda hücre, birkaç insan genine sahip homoloji ve iyi çalışılmış genetiği gibi avantajlar, C. elegans’ın hem temel biyoloji keşifleri hem de uygulamalı araştırmalar için popüler bir model haline gelmesine yol açmıştır 1,2. Hücrenin biyolojik ve gelişimsel süreçlerini, bireysel hayvanların tekrarlanan uzun vadeli gözlemlerinden anlamak, faydalı olabilir. Geleneksel olarak, C. elegans agar pedleri üzerinde anestezi altına alınır ve mikroskop altında görüntülenir. Anesteziklerin hayvan sağlığı üzerindeki olumsuz etkileri, aynı hayvanın uzun süreli ve tekrarlanan aralıklı görüntülemesi için anestezi uygulanan hayvanların kullanımını sınırlandırmaktadır 3,4. Mikroakışkan teknolojilerdeki son gelişmeler ve ihmal edilebilir sağlık tehlikeleri olan C. elegans’ın anestezik olmayan tuzaklanması için adaptasyonları, aynı hayvanın kısa ve uzun bir süre boyunca yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.
Mikroakışkan çipler, C. elegans’ın 5 yüksek verimli tarama 6,7,8, yakalama ve dağıtma9, ilaç taraması10,11, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile nöron stimülasyonu 12 ve hayvanın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi 12,13,14 için tasarlanmıştır. Slaytlarda immobilizasyon için ultra ince mikroakışkan levhalar da geliştirilmiştir15. C. elegans’ın uzun vadeli çalışmaları, sıvı kültüründe büyüyen hayvanların düşük çözünürlüklü görüntüleri kullanılarak büyümeyi, kalsiyum dinamiklerini, davranışları üzerindeki ilaç etkilerini16,17,18,19, uzun ömürlülüklerini ve20 yaşlarını gözlemlemek için gerçekleştirilmiştir. Sinaptik gelişimi değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanan uzun süreli çalışmalar21, nöronal rejenerasyon22 ve mitokondriyal ilaveyi23 olarak değerlendirmiştir. Çok kanallı cihazlarda uzun süreli yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve hücre kaderi ve farklılaşmasının takibi24,25 olarak yapılmıştır. Birkaç hücresel ve hücre altı olay, birkaç saatlik zaman ölçeklerinde meydana gelir ve hücresel dinamikleri in vivo anlamak için süreçteki tüm ara adımları karakterize etmek için gelişimleri sırasında aynı bireyin farklı zaman noktalarında yakalanmasını gerektirir. Organogenez, nöronal gelişim ve hücre göçü gibi biyolojik süreçleri görüntülemek için, hayvanın birden fazla zaman noktasında aynı yönde hareketsiz hale getirilmesi gerekir. Daha önce, dokunma reseptör nöronları (TRN’ler) boyunca mitokondrilerin nereye eklendiğini belirlemek için 36 saatten fazla C. elegans’ın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için bir protokol yayınlamıştık23.
Bu makale, tekrarlanan yüksek çözünürlüklü görüntüleme için mikroakışkan tabanlı bir metodoloji oluşturmak için bir protokol sunmaktadır. Tek bir akış kanalına sahip bu cihaz, cihaz başına tek bir hayvanın tekrarlanan görüntülenmesi için en uygun olanıdır. Verimi artırmak ve aynı anda birçok hayvanı görüntülemek için, aynı basınç hattına birden fazla cihaz bağlanabilir, ancak her cihazda tek bir hayvanı kontrol eden ayrı üç yönlü konektörlerle bağlanabilir. Tasarım, embriyonik sonrası gelişimsel süreçler, hücre göçü, organel taşınması, gen ekspresyon çalışmaları gibi yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntüler gerektiren çalışmalar için kullanışlıdır. Teknoloji, birçok geç evre hayvanın paralel büyümesini ve görüntülenmesini gerektiren yaşam süresi ve yaşlanma çalışmaları gibi bazı uygulamalar için sınırlayıcı olabilir. Polidimetilsiloksan (PDMS) elastomeri, biyostabilitesi26, biyouyumluluk27,28, gaz geçirgenliği 29,30 ve ayarlanabilir elastik modülü 31 nedeniyle bu cihazın üretimi için kullanılmıştır. Bu iki katmanlı cihaz, mikroakışkan bir kanalda sürekli gıda tedariki olan hayvanların büyümesine ve azot gazı kullanılarak PDMS membran sıkıştırması yoluyla bireysel C. elegans’ın yakalanmasına izin verir. Bu cihaz, sürekli bir gıda kaynağı altında mikrokanalda aynı hayvanı büyütme ve görüntüleme avantajı ile daha önce yayınlanmış cihazın bir uzantısıdır3. Ek izolasyon membran ağı ve 2 mm genişliğinde bir yakalama membranı, gelişmekte olan hayvanların verimli bir şekilde immobilizasyonunu sağlar. Cihaz, duyusal PVD nöronlarında nöronal gelişimi, vulval gelişimi ve dendritik arborizasyonu gözlemlemek için kullanılmıştır. Hayvanlar, cihazda olumsuz sağlık etkileri olmadan büyür ve gelişimi sırasında aynı hayvandaki hücre altı olayların görüntülenmesini kolaylaştırmak için tekrar tekrar hareketsiz hale getirilebilir.
Tüm protokol beş bölüme ayrılmıştır. Bölüm 1, büyüme ve görüntüleme çipi için cihaz imalatını açıklamaktadır. Bölüm 2, bireysel C. elegans’ı hareketsiz hale getirmek ve izole etmek için PDMS membran sapması için bir basınç sisteminin nasıl kurulacağını açıklamaktadır. Bölüm 3, cihaz görüntüleme için bir nematod büyüme ortamı (NGM) plakası üzerinde C. elegans’ın nasıl senkronize edileceğini açıklamaktadır. Bölüm 4, cihaza tek bir hayvanın nasıl yükleneceğini ve hayvanın birkaç gün boyunca mikroakışkan cihazın içinde nasıl yetiştirileceğini açıklar. Bölüm 5, bireysel bir hayvanın birden fazla zaman noktasında nasıl hareketsiz hale getirileceğini, farklı hedefler kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntülerin nasıl yakalanacağını ve Fiji’yi kullanarak görüntülerin nasıl analiz edileceğini açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, sürekli gıda arzı ve gelişimi sırasında tek bir hayvanın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi ile C. elegans yetiştirmek için basit bir mikroakışkan cihazın üretimi ve kullanımı için bir protokol tanımlanmıştır. Bu üretim süreci basittir ve steril olmayan bir ortamda yapılabilir. Tozsuz bir ortam, üretim aşamalarında kritik öneme sahiptir. Toz parçacıklarının varlığı, iki yapıştırma yüzeyi arasında yanlış temasa yol açacak ve C. elegans harek…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CIFF görüntüleme tesisi NCBS’ye, DST – Nanoteknoloji Merkezi tarafından desteklenen konfokal mikroskopların kullanımı için teşekkür ederiz (Hayır. SR/55/NM-36-2005). DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK ve Gautam Menon) tarafından desteklenen eğirme diski ve HHMI-IECS hibe numarası 55007425 (SPK) tarafından sağlanan araştırma fonlarına teşekkür ederiz. HB101, PS3239 ve wdIs51 suşları, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) tarafından sağlanmıştır. S.P.K., Mike Nonet’in laboratuvarında jsIs609’u yaptı.
Materials
| 18 G needles | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | Gauge 18 | |
| 3-way stopcock | Cole-Parmer | WW-30600-02 | Masterflex fitting with luer lock |
| CCD camera | Andor Technology | EMCCD C9100-13no | |
| Circuit board film | Fine Line Imaging, Colorado, USA | The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI) | |
| Convection Oven | Meta-Lab Scientific Industries, India | MSI-5 | |
| Coverslips | Blue stat microscopic cover glass | 22mm x 10Gms | |
| Ethanol | Hi media | ||
| Harris uni-core puncher 1mm | Qiagen | Z708801 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 440191 | |
| Hot plate | IKA | RCT B S 22 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 26895 | |
| KOH | Fisher Scientific | ||
| Laser Scanning Microscope | ZEISS | LSM 5 LIVE | |
| Micropipette tips | Tarsons | 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply | |
| Negative Photoresist-1 | Microchem | SU8-2025 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Negative Photoresist-2 | Microchem | SU8-2050 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Nitrogen gas | Local Supplier | Commercial nitrogen gas | Cylinder volume of 7 cubic meter |
| PDMS (Curing solution) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard curing solution | curing agent |
| Petri plates | Praveen Scientific Corporation | ||
| Plasma cleaner | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-32G | |
| Razor and blades | Lister surgical Blade | ||
| Silicon Elastomer (Base) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard 184 base | elastomer base |
| Silicon tubes | Fisher Scientific | Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm | |
| Silicon wafer | University Wafer, MA, USA | [100] orientation, 4-inch diameter | Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer |
| Spin Coater | SPS-Europe B.V., The Netherlands | SPIN 150 | |
| Spinning Disk microscope | Perkin Elmer ultra-view VOX system | CSU-X1-A3 N | The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package. |
| SU8 developer | Microchem, MA, USA | SU8 Developer | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 448931 | Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic |
| UV lamp | Oriel Instruments, Bangalore, India | 200 Watt and collimated UV light source | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Image analysis |
Referências
- Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
- Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), 372-385 (2011).
- Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
- Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
- Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
- Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
- Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
- Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
- Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
- Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
- Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, 159-179 (2015).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
- Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
- Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
- Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
- Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
- Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, 203-209 (2002).
- Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Biologia do Desenvolvimento. 345 (1), 18-33 (2010).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), 1285-1288 (2010).
- Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
- Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
- Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
- Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
- Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).
