Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de Caenorhabditis elegans

Summary

Le protocole décrit une conception simple de puces microfluidiques et une méthodologie de microfabrication utilisées pour cultiver C. elegans en présence d’un approvisionnement alimentaire continu jusqu’à 36 heures. Le dispositif de croissance et d’imagerie permet également une imagerie intermittente à haute résolution à long terme des processus cellulaires et sous-cellulaires pendant le développement pendant plusieurs jours.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) s’est avéré être un système modèle précieux pour l’étude des processus biologiques du développement et cellulaires. La compréhension de ces processus biologiques nécessite souvent une imagerie à long terme et répétée du même animal. Les longs temps de récupération associés aux méthodes d’immobilisation conventionnelles effectuées sur des tampons de gélose ont des effets néfastes sur la santé animale, ce qui rend inapproprié l’imagerie répétée du même animal sur de longues périodes. Cet article décrit une conception de puce microfluidique, une méthode de fabrication, un protocole de culture sur puce de C. elegans et trois exemples d’imagerie à long terme pour étudier les processus de développement chez des animaux individuels. La puce, fabriquée avec du polydiméthylsiloxane et collée sur un verre de couverture, immobilise les animaux sur un substrat de verre à l’aide d’une membrane élastomère déviée à l’aide d’azote gazeux. L’immobilisation complète de C. elegans permet une imagerie accélérée robuste des événements cellulaires et subcellulaires sans anesthésie. Une géométrie de canal avec une grande section transversale permet à l’animal de se déplacer librement dans deux membranes d’isolement partiellement scellées permettant la croissance dans le canal avec un approvisionnement continu en nourriture. À l’aide de cette puce simple, l’imagerie de phénomènes de développement tels que la croissance du processus neuronal, le développement vulvaire et l’arborisation dendritique dans les neurones sensoriels PVD, à mesure que l’animal grandit à l’intérieur du canal, peut être effectuée. La puce de croissance et d’imagerie à long terme fonctionne avec une seule conduite de pression, pas de vannes externes, des consommables fluidiques peu coûteux et utilise des protocoles standard de manipulation des vers qui peuvent facilement être adaptés par d’autres laboratoires utilisant C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans s’est avéré être un puissant organisme modèle pour étudier la biologie cellulaire, le vieillissement, la biologie du développement et la neurobiologie. Des avantages tels que son corps transparent, son cycle de vie court, son entretien facile, un nombre défini de cellules, son homologie avec plusieurs gènes humains et sa génétique bien étudiée ont permis à C. elegans de devenir un modèle populaire à la fois pour les découvertes en biologie fondamentale et la recherche appliquée ^1,2. Comprendre les processus biologiques et développementaux des cellules à partir d’observations répétées à long terme d’animaux individuels peut s’avérer bénéfique. Classiquement, C. elegans est anesthésié sur des tampons de gélose et imagé au microscope. Les effets indésirables des anesthésiques sur la santé des animaux limitent l’utilisation d’animaux anesthésiés pour l’imagerie intermittente à long terme et répétée du même animal ^3,4. Les progrès récents des technologies microfluidiques et leur adaptation au piégeage sans anesthésie de C. elegans présentant des risques négligeables pour la santé permettent d’obtenir une imagerie à haute résolution du même animal sur une courte et longue période.

Des puces microfluidiques ont été conçues pour le criblage à haut débit 6,7,8 de C. elegans’5, le piégeage et la distribution⁹, le criblage de médicaments 10,11, la stimulation neuronale avec imagerie à haute résolution 12 et l’imagerie haute résolution de l’animal ^12,13,14. Des feuilles microfluidiques ultra-minces pour l’immobilisation sur lames ont également été développées¹⁵. Des études à long terme sur C. elegans ont été réalisées à l’aide d’images à faible résolution d’animaux en culture liquide pour observer la croissance, la dynamique du calcium, les effets des médicaments sur leur comportement^16,17,18,19, leur longévité et leur vieillissement²⁰. Des études à long terme utilisant la microscopie à haute résolution ont été menées pour évaluer le développement synaptique²¹, la régénération neuronale 22 et l’addition mitochondriale²³. L’imagerie et le traçage à haute résolution à long terme du devenir et de la différenciation des cellules ont été réalisés dans des dispositifs multicanaux^24,25. Plusieurs événements cellulaires et sous-cellulaires se produisent sur des échelles de temps de plusieurs heures et nécessitent de piéger le même individu à différents moments de leur développement pour caractériser toutes les étapes intermédiaires du processus de compréhension de la dynamique cellulaire in vivo. Pour imager des processus biologiques tels que l’organogenèse, le développement neuronal et la migration cellulaire, l’animal doit être immobilisé dans la même orientation à plusieurs moments. Nous avons déjà publié un protocole d’imagerie à haute résolution de C. elegans pendant plus de 36 heures afin de déterminer où les mitochondries sont ajoutées le long des neurones récepteurs tactiles (TRN)²³.

Cet article fournit un protocole pour établir une méthodologie basée sur la microfluidique pour l’imagerie répétée à haute résolution. Ce dispositif, avec un seul canal d’écoulement, est le mieux adapté à l’imagerie répétée d’un seul animal par appareil. Pour améliorer le débit et imager plusieurs animaux à la fois, plusieurs appareils pourraient être connectés à la même ligne de pression, mais avec des connecteurs tridirectionnels séparés contrôlant un seul animal dans chaque appareil. La conception est utile pour les études qui nécessitent des images accélérées à haute résolution telles que les processus de développement post-embryonnaire, la migration cellulaire, le transport des organites, les études d’expression génique, etc. La technologie pourrait être limitative pour certaines applications telles que les études sur la durée de vie et le vieillissement qui nécessitent une croissance et une imagerie parallèles de nombreux animaux à un stade avancé. L’élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) a été utilisé pour la fabrication de ce dispositif en raison de sa biostabilité²⁶, de sa biocompatibilité^27,28, de sa perméabilité au gaz^{de 29,30} et de son module élastique accordable ³¹. Ce dispositif à deux couches permet la croissance d’animaux avec un approvisionnement continu en nourriture dans un canal microfluidique et le piégeage de C. elegans individuels via compression membranaire PDMS à l’aide d’azote gazeux. Ce dispositif est une extension du dispositif précédemment publié avec l’avantage de cultiver et d’imager le même animal dans le microcanal sous un approvisionnement alimentaire continu³. Le réseau de membranes d’isolement supplémentaires et une membrane de piégeage de 2 mm de large permettent une immobilisation efficace des animaux en développement. L’appareil a été utilisé pour observer le développement neuronal, le développement vulvaire et l’arborisation dendritique dans les neurones PVD sensoriels. Les animaux grandissent sans effets néfastes sur la santé dans le dispositif et peuvent être immobilisés à plusieurs reprises pour faciliter l’imagerie des événements subcellulaires chez le même animal au cours de son développement.

L’ensemble du protocole est divisé en cinq parties. La partie 1 décrit la fabrication du dispositif pour la puce de croissance et d’imagerie. La partie 2 décrit comment mettre en place un système de pression pour la déviation de la membrane PDMS afin d’immobiliser et d’isoler les individus de C. elegans. La partie 3 décrit comment synchroniser C. elegans sur une plaque de milieu de croissance de nématodes (NGM) pour l’imagerie de dispositifs. La partie 4 décrit comment charger un seul animal dans le dispositif et faire grandir l’animal à l’intérieur du dispositif microfluidique pendant plusieurs jours. La partie 5 décrit comment immobiliser un animal individuel à plusieurs moments, capturer des images haute résolution en utilisant différents objectifs et analyser les images à l’aide de Fidji.

Protocol

1. Fabrication d’un dispositif de croissance et d’imagerie Fabrication de moules SU8Concevez les modèles 1 (couche d’écoulement) et 2 (couche de contrôle) à l’aide de formes rectangulaires dans un logiciel de traitement de texte (ou un logiciel de CAO de conception assistée par ordinateur) et imprimez les photomasques à l’aide d’un traceur laser d’une taille minimale de 8 μm sur un film à base de polyester (Figure 1). Coupez…

Representative Results

Caractérisation de l’appareil : Le dispositif de croissance et d’imagerie se compose de deux couches PDMS liées ensemble (Figure 1) à l’aide d’une liaison plasma irréversible. La couche d’écoulement (modèle 1) de 10 mm de longueur et de 40 μm ou 80 μm de hauteur nous permet de cultiver l’animal en culture liquide (Figure 1A). La couche de piégeage (motif 2) a une membrane de 2 mm de large (Figure 1B</st…

Discussion

Dans cet article, un protocole pour la fabrication et l’utilisation d’un dispositif microfluidique simple pour la croissance de C. elegans avec un approvisionnement constant en nourriture et une imagerie à haute résolution d’un seul animal au cours de son développement a été décrit. Ce processus de fabrication est simple et peut être effectué dans un environnement non stérile. Un environnement sans poussière est essentiel pendant les étapes de fabrication. La présence de particules de poussièr…

Materials

18 G needles	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	Gauge 18
3-way stopcock	Cole-Parmer	WW-30600-02	Masterflex fitting with luer lock
CCD camera	Andor Technology	EMCCD C9100-13no
Circuit board film	Fine Line Imaging, Colorado, USA		The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven	Meta-Lab Scientific Industries, India	MSI-5
Coverslips	Blue stat microscopic cover glass		22mm x 10Gms
Ethanol	Hi media
Harris uni-core puncher 1mm	Qiagen	Z708801
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	440191
Hot plate	IKA	RCT B S 22
Isopropanol	Fisher Scientific	26895
KOH	Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope	ZEISS	LSM 5 LIVE
Micropipette tips	Tarsons		0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1	Microchem	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2	Microchem	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas	Local Supplier	Commercial nitrogen gas	Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard curing solution	curing agent
Petri plates	Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-32G
Razor and blades	Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard 184 base	elastomer base
Silicon tubes	Fisher Scientific		Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer	University Wafer, MA, USA	[100] orientation, 4-inch diameter	Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater	SPS-Europe B.V., The Netherlands	SPIN 150
Spinning Disk microscope	Perkin Elmer ultra-view VOX system	CSU-X1-A3 N	The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer	Microchem, MA, USA	SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	448931	Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp	Oriel Instruments, Bangalore, India		200 Watt and collimated UV light source
Volocity software	Perkin-Elmer		Image analysis