Summary
Eine verbesserte Plattform für die Kultur ganzer Embryonen ermöglicht eine kontinuierliche und robuste Ex-utero-Entwicklung von Postimplantations-Mausembryonen für bis zu sechs Tage, von den Vorgastrulationsstadien bis zur fortgeschrittenen Organogenese. In diesem Protokoll beschreiben wir das Standardverfahren für eine erfolgreiche Embryokultur mit statischen Platten und rotierenden Flaschensystemen.
Abstract
Postimplantations-Säugetier-Embryo-Kulturmethoden waren im Allgemeinen ineffizient und auf kurze Zeiträume nach der Dissektion aus der Gebärmutter beschränkt. Vor kurzem wurden Plattformen für eine sehr robuste und verlängerte Ex-utero-Kultur von Mausembryonen von Ei-Zylinder-Stadien bis zur fortgeschrittenen Organogenese entwickelt. Diese Plattformen ermöglichen eine angemessene und getreue Entwicklung von prägastrulierenden Embryonen (E5.5) bis zur Bildung der hinteren Gliedmaßen (E11). Spätgastrulierende Embryonen (E7.5) werden in diesen Umgebungen in rotierenden Flaschen gezüchtet, während eine erweiterte Kultur aus Vorgastrulationsstadien (E5.5 oder E6.5) eine Kombination aus statischen und rotierenden Flaschenkulturen erfordert. Darüber hinaus sind eine empfindliche Regulierung der O2 - und CO2-Konzentration , des Gasdrucks, des Glukosespiegels und der Verwendung eines spezifischen Ex-utero-Kulturmediums entscheidend für die ordnungsgemäße Embryonalentwicklung. Hier wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die erweiterte Ex-utero-Mausembryokultur bereitgestellt. Die Fähigkeit, normale Mausembryonen ex utero von der Gastrulation bis zur Organogenese zu züchten, stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die Wirkung verschiedener experimenteller Störungen während der Embryonalentwicklung zu charakterisieren.
Introduction
Die intrauterine Entwicklung des Säugetierembryos hat die Untersuchung der frühen Stadien der Postimplantationsentwicklung eingeschränkt1,2. Die Unzugänglichkeit des sich entwickelnden Embryos behindert das Verständnis der wichtigsten Entwicklungsprozesse, die nach der Implantation des Embryos in die Gebärmutter ablaufen, wie z.B. die Erstellung des tierischen Körperplans, die Spezifikation der Keimschichten oder die Bildung von Geweben und Organen. Darüber hinaus erschwert die sehr geringe Größe des frühen postimplantierten Embryos die Beobachtung durch intravitale Bildgebung in utero vor E103. Die Unfähigkeit, lebende Embryonen in diesen Stadien zu beobachten und zu manipulieren, hat die Untersuchung der frühen Embryogenese nach der Implantation auf Momentaufnahmen während der Entwicklung beschränkt.
Die Protokolle für die In-vitro-Kultur von Präimplantations-Säugetierembryonen sind gut etabliert, zuverlässig und werden regelmäßig verwendet4. Dennoch hatten Versuche, Ex-utero-Kultursysteme zu etablieren, die in der Lage sind, das richtige Wachstum von Säugetieren nach der Implantation von Embryonen zu unterstützen, nur begrenzten Erfolg5. Seit über einem Jahrhundert wird eine Vielzahl von Kulturtechniken vorgeschlagen, hauptsächlich durch Kultivierung der Embryonen in herkömmlichen statischen Platten6,7,8 oder rotierenden Flaschen (Walzenkulturen)5,9,10. Diese Plattformen erwiesen sich als hilfreich bei der Erweiterung des Wissens über die Entwicklung von Säugetieren nach der Implantation11,12, obwohl sie für das normale Überleben von Embryonen sehr ineffizient und auf kurze Zeiträume beschränkt waren. Die Embryonen zeigten bereits 24-48 h nach Beginn der Kultur Entwicklungsverzögerung und morphologische Anomalien.
Diese Studie liefert eine detaillierte Beschreibung für den Aufbau des Ex-utero-Embryokultursystems , das eine kontinuierliche Entwicklung von der Prägastrulation zu fortgeschrittenen Organogenese-Stadien über bis zu sechs Tage nach der Implantation ermöglicht13. Dieser Artikel beschreibt das verbesserte Walzenkulturprotokoll, das das Wachstum von E7.5-Embryonen (Neuralplatte und Headfold-Stadium) bis zur Hintergliedmaßenbildung (~ E11) und die erweiterte Kultur von E5.5 / E6.5 durch die Kombination von Kultur auf statischen Platten und Rollenkulturplattformen unterstützt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche wurden nach den Tierschutzrichtlinien des Weizmann Institute of Science durchgeführt und vom zuständigen Weizmann Institut IACUC genehmigt (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Gesunde schwangere Frauen wurden gebeten, ihre Einverständniserklärung zur Entnahme von Blut aus ihrer Nabelschnur zu geben, wie vom Rambam Medical Center Helsinki Committee genehmigt (#RMB-0452-15). Gesunde Erwachsene wurden um ihre informierte Zustimmung gebeten, Blut gemäß den Richtlinien des Helsinki-Komitees des Weizmann Institute of Science sammeln zu lassen (#1566-3).
1. Medienaufbereitung
- Bereiten Sie das Dissektionsmedium mit 500 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ohne Phenolrot und L-Glutamin vor, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 5 ml Penicillin / Streptomycin und filtern Sie es mit einem 0,22 μm-Filter.
HINWEIS: Halten Sie das Dissektionsmedium bis zu 1 Monat bei 4 °C. - Ex-utero-Embryokulturmedium (EUCM) jeden Kulturtag in einer biologischen Haube frisch zubereiten, wobei 25 % des embryonalen Mediums plus 50 % Rattenserum und 25 % menschliches Nabelschnurblutserum (HCS) oder menschliches Erwachsenenblutserum (HBS) verwendet werden.
- Um ein embryonales Medium herzustellen, fügen Sie 5 ml Glutamin, 5 ml HEPES und 5 ml Penicillin / Streptomycin in 500 ml DMEM ohne Phenolrot und L-Glutamin hinzu. 10-15 ml Aliquots zubereiten und bei 4 °C bis zu zwei Monate aufbewahren.
HINWEIS: Verdoppeln Sie die Antibiotikakonzentration bei Kontamination. - Das Rattenserum bei 56 °C für 30-45 min hitzeinaktivieren und durch einen 0,22 μm Polyvinylidendifluoridfilter filtriert. Verwenden Sie das Serum zur Kultur am selben Tag der Inaktivierung. Tauen Sie HCS oder HBS auf und verwenden Sie es sofort für Experimente.
HINWEIS: Kommerzielles Rattenserum liefert konsistente Ergebnisse (mindestens 4 Chargen wurden ohne offensichtliche Variation getestet). Alternativ kann hochwertiges Rattenserum wie zuvor beschrieben im eigenen Haus bezogen werden8,14. Wenn HCS nicht verfügbar ist, ersetzen Sie es durch intern gesammeltes HBS. Rattenserum, HCS und HBS können einmal wieder eingefroren und bei -20 °C zur Anwendung an einem anderen Tag aufbewahrt werden. Tauen und kombinieren Sie das refrozen Serum mit einem größeren Volumen frisch aufgetautem Serum und frieren Sie es nicht wieder ein.
2. Entnahme von menschlichem Nabelschnurblutserum und menschlichem Erwachsenenblutserum
- Um HCS zu isolieren, sammeln Sie Nabelschnurblut von gesunden schwangeren Frauen am Tag der geplanten Kaiserschnittgeburt.
- Klemmen Sie die Nabelschnur 5-7 cm vom Nabel und transsektieren Sie die Nabelschnur unmittelbar nach der Geburt des Säuglings zwischen die Klemmen.
- Ziehen Sie manuell Blut mit einer 14-G-Nadel mit großer Bohrung und einer 50-ml-Spritze direkt aus der Nabelvene, während die Plazenta vor Ort bleibt, um Spuren einer Hämolyse zu vermeiden.
HINWEIS: Sammeln Sie Blut, nachdem das Kind aus dem Operationsfeld entfernt wurde, und Nabelschnurblut für klinische Tests entnommen wurde.
- Geben Sie das gesammelte Blut auf 5 ml prokoagulatorische sterile Reagenzgläser und übertragen Sie sie sofort für 15 min auf 4 ° C, um eine vollständige Koagulation zu ermöglichen. Zentrifugieren Sie die koagulierten Reagenzgläser bei 2.500 × g für 10 min bei 4 °C.
- Entsorgen Sie Röhrchen mit Anzeichen einer Hämolyse (rosa-rotes Serum). Sammeln Sie das Serum (gelbe Farbe) mit einer 5 ml Pipette und filtrieren Sie es durch einen 0,22 μm Filter. Das Serum sofort in einem 56 °C warmen Wasserbad für 45 min wärmeinaktivieren.
- 1-1,5 ml Aliquots des inaktivierten Serums zubereiten und bei -80 °C bis zu sechs Monate aufbewahren. Bei Bedarf bei -70 °C mit Trockeneis versenden.
- Für die Serumentnahme aus menschlichem Blut bei Erwachsenen entnehmen Sie Blut von gesunden Erwachsenen und isolieren Sie sofort das Serum nach dem gleichen Protokoll, das für nabelschnurblutserum beschrieben ist. Lagern Sie das HBS als wärmeinaktivierte und filtrierte Aliquots bei -80 °C bis zu sechs Monate.
HINWEIS: Menschliches Nabelschnurserum und humanes Serum für Erwachsene, die frisch im Haus zubereitet wurden, lieferten bessere Ergebnisse als kommerziell erhältliches Serum. Sammeln Sie HCS von gesunden Frauen, über 18 Jahren und unter 40 Jahren, die für die Kaiserschnittgeburt vorgesehen sind. Schließen Sie Frauen aus, die vaginal geboren haben, und Frauen mit chronischen Krankheiten oder aktiven Erkrankungen, einschließlich Schwangerschaftsdiabetes oder Bluthochdruck.
3. Ex-utero-Walzenkultur von Embryonen von E7.5 bis E11
- Einrichtung des Rollenkultur-Inkubators und des Gasreglers
- Kultur E7.5 oder mehr fortgeschrittene Embryonen mit dem Rollkultur-Inkubatorsystem. Schalten Sie den Rotator und die Heizeinheit bei 37 °C für mindestens 1 h ein, bevor die Embryonendissektionen durchgeführt werden. Geben Sie autoklaviertes Wasser in die Gaseinlassflasche und das Auslassreagenzglas.
HINWEIS: Stellen Sie ein Thermometer neben die rotierende Trommel und überprüfen Sie häufig die Stabilität der Temperatur im Inkubator. Öffnen Sie den Inkubator so schnell wie möglich, da eine längere Öffnungszeit die Temperatur erhöht und die Embryonalentwicklung beeinträchtigt. Wenn nötig, fügen Sie mehr autoklaviertes Wasser in die Gaseinlassflasche und das Auslassreagenzglas hinzu, um sie während der Kultur auf mindestens die Hälfte der Kapazität zu halten. Schützen Sie die Embryonen im Inkubator vor Licht, indem Sie den Inkubator mit einem Tuch abdecken. - Schalten Sie das Gasreglermodul ein, indem Sie den Hauptschalter drücken und anschließend die Sauerstoff-/Stickstoff- und CO2-Regler einschalten (Abbildung 1A). Stellen Sie die Sauerstoff- und CO2-Werte mit den jeweiligen Reglern auf 5% ein. Öffnen Sie den Gasregler und stellen Sie den Gasdruck auf ~ 6,5-7 Pfund pro Quadratzoll (psi) ein, indem Sie den Spannungsschalter im Druckmessumformer bewegen (Abbildung 1B). Bestätigen Sie den Gasdruckwert mit einem digitalen Manometer.
- Überwachen Sie den Gasfluss, indem Sie die Geschwindigkeit der Blasen überprüfen, die im ausgelassenen, mit Wasser gefüllten Reagenzglas entstehen, das im Präzisionsinkubator zugewiesen ist. Stellen Sie die richtige Blasenrate ein, indem Sie das Gasdurchflussventil am Deckel der Wasserflasche schließen/öffnen. Stellen Sie sicher, dass der Gasstrom die Bildung von Blasen mit einer Geschwindigkeit von 2-4 Blasen pro Sekunde ermöglicht, oder stellen Sie den Blasenfluss an der ersten Stelle ein, an der das Blubbern in das mit Wasser gefüllte Auslassrohr austritt.
- Füllen Sie die Kulturflaschen mit 2 mL Kulturmedium und stecken Sie sie zur Vorgleichstellung für 1 h in die ausgehöhlte Drehtrommel. Verwenden Sie die ausgehöhlten Silikonspäne, um die Flaschen an der Trommel zu verschließen. Halten Sie die leeren Räume in der rotierenden Trommel mit den massiven Spundwänden abgedichtet.
HINWEIS: Das Fehlen von Blasen im Auslassrohr (kein Gas kommt durch das System) oder ein außergewöhnlich hoher Gasfluss können die Embryonalentwicklung beeinträchtigen. Im Falle eines fehlenden Blasenflusses zum Auslassreagenzglas überprüfen Sie, ob alle Silikonpfunde ordnungsgemäß in der rotierenden Trommel positioniert sind und das System abdichten, und überprüfen Sie, ob die Wasserflasche ordnungsgemäß geschlossen und alle Schläuche korrekt angeschlossen sind. Ein Mangel an Blubbern, das in die Wasserflasche gelangt, kann auf eine Fehlfunktion des Gasreglers hinweisen.
- Kultur E7.5 oder mehr fortgeschrittene Embryonen mit dem Rollkultur-Inkubatorsystem. Schalten Sie den Rotator und die Heizeinheit bei 37 °C für mindestens 1 h ein, bevor die Embryonendissektionen durchgeführt werden. Geben Sie autoklaviertes Wasser in die Gaseinlassflasche und das Auslassreagenzglas.
- Dissektion von Mausembryonen von schwangeren Mäusen
- Das Dissektionsmedium in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 für mindestens 1 h vorquilibrieren. Lassen Sie den Deckel leicht geöffnet, um den Gasaustausch zu ermöglichen.
- Opfern Sie die schwangere Frau durch zervikale Luxation, reinigen Sie den Bauch der Frau mit 70% Ethanol und schneiden Sie die Haut und Die Bauchdecke mit einer Schere ab. Lokalisieren Sie ein Ende der Gebärmutter und schneiden Sie an der Kreuzung zwischen dem Eierstock und der Gebärmutter. Als nächstes schneiden Sie entlang der Gebärmutter bis zum anderen Ende und übertragen Sie sie in eine 100 mm Petrischale, die mit dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) bei Raumtemperatur gefüllt ist.
HINWEIS: Die Verwendung von nicht hormonprimierten, natürlich gepaarten Weibchen wird empfohlen. - Waschen Sie die Conceptuse schnell in DPBS und schneiden Sie sie paarweise, um die Handhabung des Embryos zu erleichtern. Alle Konzeptpaare in eine 60-mm-Petrischale auf vorgeglichenes Seziermedium verschieben und in einzelne Conceptuse schneiden.
- Entfernen Sie die Gebärmutterwand der Conceptusse, indem Sie das Gebärmuttergewebe mit einer groben Pinzette reißen. Verwenden Sie eine feine mikrochirurgische Pinzette, um die Spitze der birnenförmigen Decidua zu schneiden. Führen Sie die Pinzette neben dem Embryo parallel zu seiner langen Achse ein und öffnen Sie die Pinzette, um die Decidua in zwei Hälften zu teilen.
- Lassen Sie schließlich den intakten Ektoplazentakegel am Eizylinder befestigt, indem Sie den Embryo aus der Decidua greifen und den parietalen Dottersack mit einer feinen Pinzette vom Embryo abziehen.
HINWEIS: Um eine Beeinflussung des Embryos zu vermeiden, führen Sie Dissektionen an einem Mikroskop durch, das mit einer Heizplatte bei 37 °C innerhalb von maximal 30-40 min ausgestattet ist. Sezieren Sie jeweils einen Wurf Embryonen. - Übertragen Sie die Embryonen unmittelbar nach der Dissektion mit einer Pasteurpipette aus Glas auf eine neue Platte, die mit einem ausgeglichenen Dissektionsmedium gefüllt ist, um zu verhindern, dass die Embryonen an den Gewebetrümmern haften bleiben.
- Wählen Sie die Embryonen im Stadium der Neuralplatte / frühen Kopffalte aus, die keine Schäden im Epiblasten zeigen, und übertragen Sie 5-6 Embryonen pro Flasche in die voremisch ausgerüsteten Glaskulturflaschen.
HINWEIS: Um die Pasteurpipette aus Glas vorzubereiten, schneiden Sie die Öffnung der Pipette mit einem Glasschneider auf eine ausreichende Größe, um in die Embryonen zu passen, und bewahren Sie sie in Ethanol auf, um eine Kontamination zu vermeiden. Waschen Sie die Glaspipette mit PBS, bevor Sie Embryonen übertragen. Achten Sie beim Transfer der Embryonen in die Kulturflasche darauf, so wenig Volumen wie möglich vom Seziermedium zu übertragen, um eine Verdünnung der EUCM zu vermeiden. - Legen Sie die Flaschen in das rotierende Kultursystem bei 37 °C, in eine Atmosphäre von 5% O2 und 5% CO2.
- Nehmen Sie jeden Tag der Kultur die Flaschen einzeln aus dem Inkubator, um die Embryonalentwicklung unter einem Stereomikroskop zu bewerten. Achten Sie darauf, das leere Loch in der Trommel mit einem festen Spund zu schließen, wenn Sie eine Flasche entfernen. Schneiden Sie die Spitze einer sterilen Pasteur-Pipette aus Kunststoff an die Embryonengröße an und bewegen Sie die Embryonen in eine Petrischale, um die Beobachtung zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen immer von Medium bedeckt sind.
HINWEIS: Minimieren Sie die Zeit, für die sich die Embryonen außerhalb des Inkubators befinden, um schädliche Auswirkungen auf die Embryonen aufgrund einer Abnahme der Körpertemperatur zu vermeiden. Behandeln Sie die Embryonen vorsichtig, um einen Bruch der Dottersack-Blutgefäße zu vermeiden, der das Überleben des Embryos beeinträchtigt. - Am Kulturtag 1 (entspricht E8.5) transferieren Sie Gruppen von 3 Embryonen in eine neue Flasche mit 2 ml frischer und vorregulierter EUCM, die zusätzliche 3 mg/ml D-Glucose und ein Gasgemisch aus 13% O2, 5% CO2 enthält.
- Nach 48 h (entspricht E9.5) Transfergruppen von zwei Embryonen in eine neue Flasche mit frisch vorgewärmtem EUCM plus 3,5 mg/ml Glucose in einer Gasatmosphäre von 18% O2 und 5% CO2.
- Bei 72 h Kultur (entspricht E10,5) jeden Embryo in eine einzelne Flasche mit 1,5-2 ml frischem Medium, ergänzt mit 4 mg/ml Glucose und einer Gaszufuhr von 21% O2 und 5% CO2.
HINWEIS: Embryonen erreichen ihr maximales Wachstum gegen Mitternacht des Kulturtages 4. - Verwenden Sie eine feine Pinzette, um den Dottersack und das Amnion zu entfernen, und lösen Sie die Nabelschnur, um die Morphologie des Embryos richtig zu beobachten. Schalten Sie das Gasregulierungsmodul und den Präzisionsinkubator aus.
HINWEIS: Das Kulturmedium für 1 Stunde durch Inkubation in einer Glasflasche in der Walzenkultur mit einer entsprechenden Gasatmosphäre entsprechend dem Embryostadium vorquilibrieren. Reinigen Sie die Kulturflaschen und alle Inkubatorgläser nach jedem Gebrauch, indem Sie drei Wäschen mit fließendem destilliertem Wasser durchführen, gefolgt von einer Nachtwäsche, die in 70% Ethanol getaucht ist. Dreimal mit fließendem destilliertem Wasser nachspülen, die Flaschen über Nacht trocknen lassen und per Autoklav sterilisieren. Ebenso autoklavieren Sie die Silikonstopfen regelmäßig. Reinigen Sie alle Dissektionswerkzeuge gründlich mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie trocken.
4. Erweiterte Embryokultur von E5.5/E6.5 bis E11
- Kultur vorgastrullieren (E5.5) und frühe Gastrulation (E6.5) Embryonen bis zum frühen Somite-Stadium (E8.5) in statischen Platten.
- Das Dissektionsmedium für 1 h in einem Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C vorquilibrieren.
HINWEIS: Um den Gasaustausch zu ermöglichen, schließen Sie den Deckel des Rohres nicht vollständig. - Bereiten Sie die Kulturplatten vor, indem Sie 250 μL frisch zubereitetes EUCM in jede Vertiefung geben. Legen Sie die Platten zur Vorgleichgewichtung in einen CO2-Inkubator bei 37 °C.
HINWEIS: Obwohl 8-Well-Platten gut für das Embryonenwachstum geeignet sind, kann die Kultur in jeder anderen Platte durchgeführt werden, indem das Volumen des Mediums entsprechend der Größe der Platte eingestellt wird. - Sezieren Sie Eizylinderembryonen aus der Gebärmutter nach der für E7.5 beschriebenen Technik. Entfernen Sie den parietalen Dottersack des Embryos und lassen Sie den intakten Ektoplazentakegel am Eierzylinder befestigt.
- Einzelne Embryonen mit einer Mikropipette in jeden Brunnen der 8-Well-Platte übertragen und die Platte mit 5% CO2 bei 37 °C in den Inkubator geben.
- Stellen Sie sich die Embryonen unter einem Stereomikroskop vor und wählen Sie für die Kultur nur diejenigen mit einer wohlgeformten Fruchthöhle aus, ohne offensichtliche Schäden und ohne die Reichert-Membran.
HINWEIS: Verwenden Sie 20 μL Pipettenspitzen, um E5,5-Embryonen zu übertragen, und 200 μL-Spitzen, um E6,5-Embryonen zu übertragen. Bei Kulturen ab E6.5 kann HCS durch frisch gesammelte HBS ersetzt werden. - Entfernen Sie die Hälfte des Mediums und fügen Sie nach 24 h Kultur 250 μL frisch zubereitetes vorgewärmtes EUCM hinzu, um sicherzustellen, dass die Embryonen immer in das Kulturmedium eingetaucht sind. Im Falle von Kulturen, die bei E5.5 beginnen, werden nach zwei Tagen Kultur (entspricht E7.5) 200 μL entfernt und 250 μL neues EUCM hinzugefügt.
HINWEIS: Während der statischen Kultur können sich Embryonen an der Platte festsetzen (hauptsächlich bei Verwendung von Kunststoffplatten), was die Embryonalentwicklung stark beeinträchtigt. Die Befestigung des Embryos an der Platte ist am ersten Tag der Kultivierung von E5,5-Embryonen häufiger. Um eine Anhaftung zu verhindern, drücken Sie die Embryonen vorsichtig mit einer feinen, sterilen Pinzette von der Plattenoberfläche weg. Stellen Sie sicher, dass nur der Ektoplazentakegel an der Oberfläche der Platte befestigt bleibt. - Transfer der Embryonen in die Walzenkultur im frühen Somite-Stadium (4-7 Somiten; nach drei Tagen Kultur für Embryonen, die bei E5,5 explantiert wurden, und zwei Tagen für Kulturen, die bei E6.5 begonnen wurden), nach den gleichen Indikationen, die zuvor für Embryonen im E8.5-Stadium beschrieben wurden.
HINWEIS: Der Transfer der Embryonen in die Walzenkultur in anderen als den oben angegebenen Stadien führt zu einem Versagen der weiteren Entwicklung. Im Gegensatz zu E7.5 ex utero Kulturen ist es möglich, die Embryonen in einer konstanten Atmosphäre von 21% Sauerstoff und 5% CO2 zu halten, was eine etwas höhere Effizienz der Embryonalentwicklung bietet als Atmosphären mit dynamischer Sauerstoffkonzentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die für E7.5-Embryonen beschriebenen Walzenkulturbedingungen (Spätgastrulationsstadium) unterstützen ein konstantes und normales Embryowachstum mit einer durchschnittlichen Effizienz von fast 75% nach 4 Kulturtagen (Abbildung 2 und Tabelle 1). Die Effizienz der Embryonalentwicklung kann je nach genetischem Hintergrund der Maus variieren, ist aber durchweg robust (Abbildung 2C). Die Supplementierung mit HBS anstelle von HCS ergibt eine Effizienz von ~ 68% nach 4 Tagen Ex-utero-Kultur , abhängig vom genetischen Hintergrund der Mäuse (Abbildung 2D und Tabelle 2). Die ex utero entwickelten Embryonen rekapitulieren die richtige Entwicklung bis etwa zum 44-somite-Stadium. Danach zeigen die Embryonen embryonale Anomalien aufgrund des Fehlens der allantoischen Plazenta, was angesichts der erhöhten Körpergröße in diesem Stadium zu einer unzureichenden Sauerstoffversorgung und Nährstoffversorgung führt.
Die Entwicklung von E6.5-Embryonen (Early-Streak) in statischen Platten wird korrekt mit einer Effizienz von >90% bis zum frühen Somite-Stadium E8.5 rekapituliert, wobei EUCM sowohl mit HCS als auch mit HBS verwendet wird (Abbildung 3, Tabelle 3 und Tabelle 4) (siehe 8,13 für eine detaillierte Beschreibung des Embryo-Stagings zwischen E5.5 und E8.5). Die Ex-utero-Kultur von der Gastrulation bis zur fortgeschrittenen Organogenese durch Kombination von Kulturen auf statischen Platten, gefolgt von der Walzenkultur in einer konstanten Sauerstoffatmosphäre von 21%, ergibt eine geschätzte Effizienz der richtigen Entwicklung von 55% bzw. 26% bis zum 44-Somite-Stadium unter Verwendung von HCS bzw. HBS (Abbildung 3A, Tabelle 3 und Tabelle 4). Es gibt eine Verzögerung von 1-2 Somit-Paaren in diesen Embryonen im Vergleich zu Embryonen, die in utero entwickelt wurden. Der größte Effizienzabfall tritt beim Übergang von E8,5 zu E9,5 aufgrund des Versagens der axialen Drehung und des Verschlusses des Neuralrohrs auf.
Kulturen, die von E5.5 prägastrulierenden Embryonen ausgehen, zeigen eine Effizienz der richtigen Entwicklung bis zum frühen Somite-Stadium (E8.5) von etwa 46%, und fast 17% der Embryonen werden nach sechs Tagen der Kultur nach dem Transfer in die Walzenkultur die richtige Entwicklung abschließen (Abbildung 4 und Tabelle 5). Eine verlängerte Ex-utero-Kultur verlängert die Entwicklungsverzögerung in den Embryonen, wobei Embryonen, die bei E5,5 explantiert wurden, eine Verzögerung von 2-4 Sondenpaaren im Vergleich zu In-vivo-Embryonen zeigen. Dennoch schreiten die Morphogenese und die Gewebeentwicklung bis etwa zum 42-Somite-Stadium ordnungsgemäß voran.
Die häufigsten Defekte, die in den Embryonen für Kulturen beobachtet wurden, die aus E7.5, E6.5 und E5.5 initiiert wurden, sind in Abbildung 5A-C veranschaulicht. Zum Zeitpunkt der Dissektion sollten Embryonen mit auch nur geringfügigen Schäden am Epiblasten oder der extraembryonalen Region sowie Embryonen, die die Reichert-Membran behalten, verworfen werden. Ebenso wachsen frühe Embryonen nicht richtig (siehe Abbildung 5B für abgestorbene Embryonen) oder weisen schwere Entwicklungsverzögerungen auf (siehe Abbildung 5B für einen verzögerten Embryo). Die Befestigung des embryonalen Epiblasten an der Oberfläche der Platte beeinflusst die Entwicklung in Abhängigkeit von der Position und dem Grad der Befestigung. Die Anheftung eines Teils des Epiblasten oder des gesamten Embryos führt zum Versagen der weiteren Entwicklung (siehe Abbildung 5B für einen angehängten Embryo).
Die wichtigsten Anomalien, die beim Prozentsatz der defekten Embryonen bei E8.5 (frühes Somite-Stadium) beobachtet wurden, sind die Entwicklung der hinteren Region außerhalb des Dottersacks oder Defekte im Wachstum der Nervenfalten (Abbildung 5A,B). Bei Kulturen, die bei E5,5 begonnen wurden, ist ein häufig beobachteter Entwicklungsdefekt das Vorhandensein eines kleinen, unterentwickelten Epiblasten (Abbildung 5C). Zum Zeitpunkt, der E9.5 entspricht, stellen Defekte im Verschluss der nervenöstlichen Falten, Versagen der axialen Drehung oder ein Mangel am Gehirnwachstum die am häufigsten beobachteten Anomalien dar (Abbildung 5). Die am häufigsten beobachteten Entwicklungsdefekte bei E10,5/E11 sind Anomalien im Kopfbereich, Störung der normalen Durchblutung im Dottersack und Perikarderguss (Abbildung 5). Der Bruch eines Hauptblutgefäßes und der Blutabfluss können zum späteren Tod des Embryos führen. Insbesondere kann das richtige Wachstum des Embryos selbst auch ohne offensichtliche Dottersackzirkulation erreicht werden. Embryonen, die in Kultur über das Stadium hinaus gehalten werden, das E11 entspricht, zeigen nach wenigen Stunden aufgrund eines Mangels an richtiger Gewebeoxygenierung eine Körperschrumpfung und einen Tod.
Abbildung 1: Gas- und Druckregelungssystem, angepasst an einen Walzenkultur-Inkubator. (A) Draufsicht auf das Gasregelungsmodul, das mit dem Walzenkultur-Inkubator verbunden ist. N2 und CO2 gelangen in den Gasregler, um eine präzise Kontrolle der Sauerstoff-/CO2-Konzentrationen und des Gasdrucks zu ermöglichen. Die Gase werden auf den Mischkasten gerichtet, in dem sie von einem Radialgebläse gemischt und durch eine Pumpe, die Überdruck erzeugt, in den Inkubator injiziert werden. Das Gas fließt durch den Einlass in eine Wasserflasche und später in die verschlossenen Flaschen. (B) Interne Konfiguration des Elektronischen Moduls zur Gas- und Druckregelung. Der am Druckmessumformer eingestellte Spannungswert regelt den von der Pumpe im Gasmischkasten erzeugten Druck (5-6 V, um in diesem speziellen Modell einen Druck von 6-7 psi zu erreichen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ex-utero-Kulturplattform unterstützt das Wachstum von E7,5-Embryonen bis zur fortgeschrittenen Organogenese. (A) Diagramm, das das E7.5 ex utero Embryo-Kulturprotokoll darstellt. (B) Repräsentative Hellfeldbilder von Gruppen kultivierter Embryonen, die sich ex utero über 4 Tage entwickeln, von der späten Gastrulation (E7.5) bis zum 44-Somite-Stadium (E11). Die typische Variation der Sondenzahl, die alle 24 h bewertet wird, wird angezeigt. Skalenbalken = 500 μm. (C, D) Prozentsatz der normal entwickelten Embryonen nach 1-4 Tagen Kultur ab E7.5 geteilt durch Mause-Elternstämme und Serumergänzung (C, humanes Nabelschnurblutserum; D, menschliches Blutserum für Erwachsene). Panel A wurde von 13 geändert. Abkürzungen: EUCM = ex utero embryo culture medium; HCS = menschliches Nabelschnurblutserum; HBS = menschliches Blutserum für Erwachsene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Erweitertes Ex-utero-Kulturprotokoll für das Züchten von E6.5 frühgastrulierenden Mausembryonen bis zur späten Organogenese. (A) Schematische Darstellung des erweiterten Ex-utero-Kulturprotokolls , das statische Platten und rotierende Flaschensysteme kombiniert. (B) Hellfeldbilder von Embryonen, die ex utero fünf Tage lang von E6,5 bis zum 44-Somite-Stadium kultiviert wurden. Die typische Variation der Sondenzahl, die alle 24 h bewertet wird, wird angezeigt. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Kontinuierliche Ex-utero-Kultur von Mausembryonen vor der Vorgastrulation von E5.5 bis zum späten Organogenesestadium. (A) Schematische Darstellung der Ex-utero-Kultur des Protokolls für E5.5-Embryonen. (B) Repräsentative Hellfeldbilder von Embryonen, die sechs Tage lang ex utero von E5,5 bis zum 42-somite-Stadium kultiviert wurden. Die typische Variation der Sondenzahl, die alle 24 h bewertet wird, wird angezeigt. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Entwicklungsdefekte, die bei Embryonen beobachtet wurden, die ex utero kultiviert wurden. (A-C) Hellfeldmikroskopische Aufnahmen von abnormalen Mausembryonen, die ex utero ausgehend von E7.5 (A), E6.5 (B) oder E5.5 (C) gezüchtet wurden. Eine allgemeine Beschreibung des Fehlers ist auf jedem Bild enthalten. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Effizienz der richtigen Entwicklung von Embryonen, die bei E7,5 Tagen nach dem Koitum isoliert wurden. Die Embryonen wurden ex utero für 4 Tage in EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum) kultiviert. [-] zeigt Kulturen an, die aufgrund experimenteller Anforderungen nicht fortgesetzt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Effizienz der richtigen Entwicklung von Embryonen, die bei E7.5 isoliert wurden, ex utero für 4 Tage kultiviert wurden, wobei menschliches Nabelschnurblutserum durch frisch isoliertes menschliches Blutserum für Erwachsene ersetzt wurde. [-] zeigt Kulturen an, die aufgrund experimenteller Anforderungen nicht fortgesetzt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Effizienz der richtigen Entwicklung von Embryonen (B6D2F1/ICR), die bei E6.5 isoliert und ex utero für 5 Tage mit EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum) kultiviert wurden. Die Ex-utero-Kultur wurde in statischer Kultur für zwei Tage (21% O2) durchgeführt, gefolgt von drei Tagen in rotierenden Flaschen bei 21% O2. [-] zeigt Kulturen an, die aufgrund experimenteller Anforderungen nicht fortgesetzt werden. Abkürzung: NA = nicht erworben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: Effizienz der richtigen Entwicklung von Embryonen (B6D2F1/ICR), die bei E6.5 isoliert und ex utero ex utero mit EUCM kultiviert wurden (Ersetzen des Human Umbilical Cord Blood Serum durch frisch isoliertes Human Adult Blood Serum). Die Embryonen wurden in statischer Kultur für zwei Tage (21% O2) entwickelt, gefolgt von drei Tagen in rotierenden Flaschen bei 21% O2. [-] zeigt Kulturen an, die aufgrund experimenteller Anforderungen nicht fortgesetzt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 5: Effizienz der richtigen Entwicklung von Embryonen (B6D2F1/ICR), die bei E5.5 isoliert und ex utero für 6 Tage mit EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum) kultiviert wurden. Die Embryonen wurden in statischer Kultur für drei Tage (21% O2) entwickelt, gefolgt von drei Tagen in rotierenden Flaschen bei 21% O2. [-] zeigt Kulturen an, die aufgrund experimenteller Anforderungen nicht fortgesetzt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das hier vorgestellte Kulturprotokoll kann die ordnungsgemäße und kontinuierliche Entwicklung des Mausembryonen ex utero für bis zu sechs Tage von E5.5 bis E11 aufrechterhalten. Zuvor konnten sich Embryonen in diesen Entwicklungsstadien nur für kurze Zeiträume (bis zu 48 h)15 normal in Kultur entwickeln. Die Kopplung des Gasregulationsmoduls an den Rollenkultur-Inkubator zur präzisen Kontrolle der Sauerstoffkonzentration und des hyperbaren Gasdrucks ist entscheidend für die hierin beschriebene richtige Mausembryokultur. Die Erhöhung des Gasdrucks auf 7 psi erhöht die Sauerstoffdiffusion und ermöglicht die Embryonalentwicklung bis zu E11 in einer Atmosphäre von bis zu 21% O2 / 5% CO2, im Gegensatz zu den zuvor verwendeten Bedingungen von 95% O216, die für den Embryo langfristig schädlich sein können. Darüber hinaus ist bekannt, dass die Sauerstoffkonzentration eine entscheidende Rolle bei der Embryonalentwicklung spielt, da die frühe Embryogenese nach der Implantation unter hypoxischen Bedingungen stattfindet17. Dementsprechend erfordert die erfolgreiche Kultur spätgastrulierender Embryonen eine anfängliche 5% ige O2-Atmosphäre mit einem dynamischen Anstieg der Sauerstoffkonzentration mit dem Wachstum des Embryos. Bemerkenswerterweise verringerte die Kultivierung prä-/frühgastrulierender Embryonen in statischer Kultur bei 5% O2 drastisch die Effizienz der richtigen Embryonalentwicklung im Vergleich zu 21% O2, und sie konnten sich nicht weiter zu E9.5 entwickeln. Letzteres könnte durch die langsamere Rate der Nährstoff- und Sauerstoffdiffusion durch die embryonalen Gewebe in der statischen Kultur im Vergleich zur Kultur in rotierenden Flaschen erklärt werden1,10.
Darüber hinaus liefert der hohe Gehalt an Nabelschnurblutserum von Ratten und Menschen konsistentere Ergebnisse für das Wachstum früher postimplantierter Embryonen als Medien, die nur mit Rattenserum ergänzt werden13,18. Wichtig ist, dass das für die Embryokultur verwendete Serum aus frisch extrahiertem Blut hergestellt werden sollte. Obwohl hochwertiges Rattenserum für die Kultur ganzer Embryonen im Handel erhältlich ist, sollte das menschliche Serum intern isoliert werden. Die Supplementierung mit menschlichem Nabelschnurblutserum kann durch serum ersetzt werden, das aus menschlichem erwachsenen Blut isoliert wurde, das allgemein zugänglich ist und dennoch ein konsistentes und effizientes Embryonenwachstum ermöglicht.
Eine erfolgreiche und effiziente Embryonalentwicklung ex utero hängt auch in hohem Maße von einer genauen Embryoisolierung ab. Zunächst sollte der Dissektionsvorgang in einem bei 37 °C erwärmten Dissektionsmedium durchgeführt werden, und die sezierten Embryonen sollten innerhalb von 30 min in die Kulturflaschen/-platten überführt werden. Zweitens ist die präzise Embryonenisolierung aus der Dezidua und die Entfernung der Reichert-Membran ohne Beschädigung des Epiblasten der Schlüssel zu einer hohen Effizienz der Embryonalentwicklung. Drittens sollten nur Embryonen im geeigneten Stadium für die Kultur ausgewählt werden, da frühe/verzögerte Embryonen nicht richtig wachsen.
Der Umgang mit den Embryonen während des Transfers ist ein weiterer wesentlicher Punkt während der Ex-utero-Kultur , hauptsächlich nach der Entwicklung des embryonalen Dottersacks. Embryonen sollten vorsichtig übertragen werden, da Schäden an großen Dottersack-Blutgefäßen die richtige Entwicklung beeinträchtigen könnten. Im Allgemeinen gilt: Je länger die Periode der Embryokultur ist, desto geringer ist die Effizienz der normalen Embryonalentwicklung, d.h. Embryonen, die bei E7.5 explantiert werden, entwickeln sich mit höherer Effizienz als embryonierte Embryonen mit höherer Effizienz als embryonierte Embryonenentwicklung. Darüber hinaus ist das Vorhandensein von Antibiotika im Medium von grundlegender Bedeutung, um eine Kontamination zu verhindern, wenn ein Dissektionsmikroskop, das in einer biologischen Haube zugewiesen ist, nicht verfügbar ist.
Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass andere Plattformen, Druckniveaus oder Bedingungen ähnliche oder verbesserte Ergebnisse wie die mit dem vorliegenden Protokoll erzielten Ergebnisse ermöglichen. Eine weitere Optimierung der in dieser Studie beschriebenen Bedingungen ist erforderlich, um eine Effizienz der Embryonalentwicklung zu erreichen, die derjenigen entspricht, die bei der intrauterinen Entwicklung beobachtet wird. Darüber hinaus könnte die zukünftige Entwicklung eines definierten serumfreien Mediums dazu beitragen, die spezifischen metabolischen und chemischen Anforderungen während der Embryonalentwicklung von Säugetieren zu definieren und die Serumvariabilität von Charge zu Charge zu reduzieren. Die Notwendigkeit einer konstanten Nährstoff- und Gasmischung nach E8.5 unter Verwendung der rotierenden Flaschenkultur in den aktuellen Einstellungen schränkt die langfristigen Bildgebungsfähigkeiten während der Organogenesephasen ein. Die zukünftige Entwicklung von Mikrofluidik-Geräten, die eine Gas- und Nährstoffmischung in statischer Kultur in Verbindung mit Mikroskopie-Setups ermöglichen, könnte dazu beitragen, diese Herausforderung zu meistern.
Embryonen , die ex utero kultiviert werden, können experimentell manipuliert und in Kultur bis zu fortgeschrittenen Organogenese-Stadien außerhalb der Gebärmutter aufbewahrt werden. Wir haben zuvor die Fähigkeit gezeigt, verschiedene Störungen in sich entwickelnde Embryonen einzuführen, wie genetische Manipulation durch Elektroporation oder lentivirale Infektion, Live-Bildgebung, Zelltransplantation und teratogene Studien13. Letztendlich kann diese Plattform dazu beitragen, die Spezifikation des Zellschicksals und die Mechanismen der Organbildung bei Säugetieren aufzudecken, indem sie Echtzeitexperimente an lebenden Mausembryonen für bis zu sechs Tage der frühen Postimplantationsentwicklung ermöglicht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.H.H ist Berater von Biological Industries Ltd und hat eine Patentanmeldung eingereicht, die die hierin beschriebenen Walzen- und statischen Kulturbedingungen abdeckt (eingereicht von J.H.H. und dem Weizmann Institute of Science). Andere Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Pascal und Ilana Mantoux finanziert; Europäischer Forschungsrat (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Flight Attendant Medical Research Council (FAMRI); Professur des Israel Cancer Research Fund (ICRF), BSF, Helen and Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen and Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, das Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella und Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David und Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Nachlass von Zvia Zeroni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al.
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F.
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
