Summary
Wir zeigen, wie man ein murines Modell der Lungenwurzelimplantation in die absteigende Aorta etabliert, um das Ross-Verfahren zu simulieren. Dieses Modell ermöglicht die mittel- / langfristige Bewertung des pulmonalen Autotransplantat-Remodelings in einer systemischen Position und stellt die Grundlage für die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Förderung seiner Anpassung dar.
Abstract
Die Ross-Operation für Aortenklappenerkrankungen hat aufgrund ihrer hervorragenden Langzeitergebnisse wieder neues Interesse geweckt. Dennoch wird beim Einsatz als freistehender Wurzelersatz die mögliche Erweiterung des Lungenautotransplantats und die anschließende Aorteninsuffizienz beschrieben. Mehrere Tiermodelle wurden vorgeschlagen. Diese beschränken sich jedoch in der Regel auf Ex-vivo-Modelle oder In-vivo-Experimente mit relativ teuren Großtiermodellen. In dieser Studie versuchten wir, ein Nagetiermodell der Implantation von Lungenarterientransplantaten (PAG) in einer systemischen Position zu etablieren. Insgesamt wurden 39 erwachsene Lewis-Ratten eingeschlossen. Unmittelbar nach der Euthanasie wurde die Lungenwurzel von einem Spendertier geerntet (n=17). Syngene Empfänger- (n=17) und scheinoperierte (n=5) Ratten wurden sediert und beatmet. In der Empfängergruppe wurde dem PAG eine End-to-End-Anastomose in infrarenaler Bauchaortenposition implantiert. Scheinoperierte Ratten wurden nur einer Transektion und Reanastomose der Aorta unterzogen. Die Tiere wurden mit seriellen Ultraschalluntersuchungen für zwei Monate und postmortalen histologischen Analysen verfolgt. Der mittlere PAG-Durchmesser in der nativen Position betrug 3,20 mm (IQR = 3,18-3,23). Bei der Nachbeobachtung betrug der mediane Durchmesser des PAG 4,03 mm (IQR = 3,74-4,13) nach 1 Woche, 4,07 mm (IQR = 3,80-4,28) nach 1 Monat und 4,27 mm (IQR = 3,90-4,35) nach 2 Monaten (p<0,01). Die maximale systolische Geschwindigkeit betrug 220,07 mm/s (IQR=210,43-246,41) nach 1 Woche, 430,88 mm/s (IQR=375,28-495,56) nach 1 Monat und 373,68 mm/s (IQR=305,78-429,81) nach 2 Monaten (p=0,02) und unterschied sich nicht von der scheinoperierten Gruppe am Ende des Experiments (p=0,5). Die histologische Analyse zeigte keine Anzeichen einer Endothelthrombose. Diese Studie zeigte, dass Nagetiermodelle die Bewertung der langfristigen Anpassung der Lungenwurzel an ein Hochdrucksystem ermöglichen können. Eine systemisch platzierte syngene PAG-Implantation stellt eine einfache und praktikable Plattform für die Entwicklung und Bewertung neuartiger Operationstechniken und medikamentöser Therapien dar, um die Ergebnisse der Ross-Operation weiter zu verbessern.
Introduction
Die angeborene Aortenklappenstenose ist eine Untergruppe der angeborenen Herzkrankheit, die durch eine Obstruktion des linksventrikulären Traktes gekennzeichnet ist, bei der sich die Läsion auf der Valvularebene befindet. Die Fehlbildung betrifft etwa 0,04-0,38 pro 1000 Lebendgeburten1.
Die verfügbaren Optionen für die Korrektur sind vielfältig, jede mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen. Bei Patienten, die für eine biventrikuläre Korrektur2 geeignet sind, kann der Ansatz auf eine Klappenreparatur (perkutane oder chirurgische Valvulotomie) oder deren Ersatz abzielen3. Letzteres ist bevorzugt, wenn die Aortenklappe als unrettbar gilt; Die verfügbaren Optionen sind jedoch für pädiatrische Patienten begrenzt. Tatsächlich sind bioprothetische Klappen aufgrund ihrer frühen Verkalkung nicht für den Aortenersatz in der jungen Bevölkerung indiziert4. Auf der anderen Seite ist die Degeneration in mechanischen Klappen wesentlich langsamer, aber diese erfordern eine lebenslange Antikoagulanzientherapie5. Darüber hinaus wird die Haupteinschränkung dieser Prothesen durch das fehlende Wachstumspotenzial dargestellt, das die Patienten für zusätzliche Reinterventionen prädisponiert.
Eine interessante Therapieoption in der pädiatrischen Population ist die Übertragung des pulmonalen Autotransplantats auf die Aortenposition namens "Ross-Operation". In diesem Fall wird die Pulmonalklappe dann durch ein Homotransplantat ersetzt (Abbildung 1)6. Dieses Verfahren kann möglicherweise die beste chirurgische Wahl für Kinder darstellen, da das Lungenautotransplantat sein Wachstumspotenzial bewahrt und nicht die Risiken einer lebenslangen Gerinnungshemmungstherapie birgt. Darüber hinaus kann das Ross-Verfahren auch bei jungen Erwachsenen von großem Wert sein, um eine mechanische oder biologische Klappe zu vermeiden, die das Potenzial hat, die beste chirurgische Lösung zu werden.
Die Ergebnisse nach Aortenklappenersatz mit pulmonalem Autotransplantat sind ausgezeichnet, mit einem Überleben von mehr als 98% und guten Langzeitergebnissen7. Literaturstudien berichten von 93% bzw. 90% Freiheit vom Ersatz des Lungenhomotransplantats nach 4 bzw. 12 Jahren8.
Die Haupteinschränkung dieses Verfahrens ist die Tendenz des Autotransplantats, sich langfristig zu erweitern, insbesondere wenn es als freistehender Wurzelersatz eingesetzt wird. Dies kann zu einer klappenförmigen Inkompetenz führen, die eine erneute Intervention erfordern kann. Tatsächlich berichtet die bisher am längsten durchgeführte Follow-up-Studie von einer Reoperationsfreiheit für den Autotransplantatersatz von 88% nach 10 Jahren und 75% nach 20 Jahren9.
Die Möglichkeit, eine Ross-Operation in einem experimentellen Setting nachzubilden, stellt eine Grundvoraussetzung dar, um den zugrunde liegenden Mechanismus der Anpassung des pulmonalen Autotransplantats an systemische Belastungen zu untersuchen. In der Vergangenheit wurden mehrere Modelle vorgeschlagen. Diese beschränken sich jedoch meist auf Ex-vivo-Experimente oder In-vivo-Tiermodelle mit relativ teuren Großtieren. In dieser Studie versuchten wir, ein Nagetiermodell der Implantation von Lungenarterientransplantaten (PAG) in einer systemischen Position als freistehende Wurzel zu etablieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren wurden vom Tierpflegeausschuss der Universität Padua (OPBA, Protokollnummer Nr. 55/2017) genehmigt und vom italienischen Gesundheitsministerium (Genehmigung Nr. 700/2018-PR) in Übereinstimmung mit der Richtlinie 2010/63/EU der Europäischen Union und dem italienischen Gesetz 26/2014 über die Pflege und Verwendung von Versuchstieren genehmigt.
1. Tierpflege und Versuchsmodell
- Stellen Sie sicher, dass alle Lewis-Ratten von einem einzigen Unternehmen bezogen werden (Materialtabelle). Halten Sie die Ratten in konventionellen Einrichtungen mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.
- Stellen Sie sicher, dass das Gewicht der Ratten zwischen 320 und 400 g für die Empfängergruppe und 200-250 g für die Spendergruppe liegt.
2. Präoperatives Protokoll
HINWEIS: Alle Operationen müssen unter sauberen Bedingungen durchgeführt werden. Verwenden Sie männliche und weibliche erwachsene Lewis-Ratten als Empfänger und Spender, um eine syngene Transplantation durchzuführen.
- Führen Sie 15 Minuten vor der Operation eine intraperitoneale Injektion von Tramadol (5 mg/kg) durch.
- Verabreichen Sie unmittelbar vor der Operation eine Einzeldosis intramuskuläres Gentamicin (5 mg/kg).
- Zur Anästhesieinduktion 4% Sevofluran in 1 l/min Sauerstoff in eine Poly(methylmethacrylat)-Kammer geben, in der das Tier platziert wird. Verwenden Sie zur Aufrechterhaltung der Anästhesie während des gesamten Verfahrens 2,0-2,5% Sevofluran in 1 l / min Sauerstoff.
- Rasieren Sie das Tier entlang der Mittellinie für 2 cm Breite vom Brustbein bis 1 cm über dem Genitalbereich mit einem Rasiermesser. Dann sterilisieren Sie die Haut mit Jodlösung.
- Um zu verhindern, dass das Tier nass wird und um eine Wärmeausbreitung während der Operation zu verhindern, bedecken Sie das Tier mit einer transparenten Kunststofffolie.
- Bewerten Sie das Niveau der Anästhesie vor der Durchführung des Verfahrens, indem Sie das Fehlen einer Reaktion auf einen schädlichen Reiz beurteilen.
3. Geberbetrieb
- Tier- und Herzpräparation:
- Legen Sie das betäubte Tier auf ein Korktablett mit der Schwanzseite zum Chirurgen. Führen Sie einen xipho-schamartigen Schnitt von ca. 5-6 cm durch und ziehen Sie die beiden muskulokutanen Klappen seitlich zurück.
- Verabreichen Sie ein Volumen von 1 ml Kochsalzlösung bei 4 °C mit 500 IE Heparin durch die abdominale Hohlvene.
- Schneiden Sie nach 1 Minute das Zwerchfell von links nach rechts und führen Sie eine vordere Thorakotomie durch, um das Herz freizulegen.
- Kühlen Sie das schlagende Herz ab, indem Sie Kochsalzlösung bei 4 °C tropfen lassen.
- Führen Sie eine Perikardektomie und eine Thymektomie durch, um einen vollständigen Überblick über den Aortenbogen zu erhalten. Entfernen Sie das verbleibende Fettgewebe, das die Aorta umgibt.
- Schnitt am Bogen, knapp über dem Ursprung der innominaten Arterie; Trennen Sie auch die letztere.
- Schneiden Sie die thorakale Vena cava inferior (IVC) ab und führen Sie eine 22 G Kanüle ein, um das Herz mit 20-25 ml Kochsalzlösung bei 4 ° C unter leichtem Druck zu infundieren. Beenden Sie die Durchblutung, wenn das Herz aufhört zu schlagen und der Fluss aus der Aorta klar wurde.
- PAG explant:
HINWEIS: Eine genaue Ernte und schonende Handhabung des PAG ist zwingend erforderlich, um eine optimale Implantation beim Empfänger zu erreichen. Berühren Sie es nicht direkt mit Instrumenten, sondern verwenden Sie Stattdessen Wattestäbchen.- Führen Sie eine Ultraschalluntersuchung durch, um den PA-Durchmesser in seiner nativen Position zu beurteilen.
- Führen Sie eine Mikrozange unter die hintere Wand des Gefäßes ein und schneiden Sie diese mit einer Mikroschere so nah wie möglich an ihrer Verzweigung, um die Länge des PAG zu maximieren.
- Halten Sie die PA vorsichtig mit der ringförmigen Mikrozange fest und trennen Sie sie mit der Mikrofederschere von der rechten Herzkammer. Ernte den PAG, einschließlich einiger rechtsventrikulärer Muskeln.
- PAG-Vorbereitung:
- Legen Sie den PAG auf eine mit kalter Kochsalzlösung angefeuchtete Gaze auf den Operationstisch und untersuchen Sie das Gefäß unter dem Operationsmikroskop.
- Schneiden Sie reichlich vorhandenes umgebendes Gewebe ab und lassen Sie nur 1 mm Ventrikelmuskel zurück. Stellen Sie die Länge des Behälters auf 5 mm ein.
4. Implantation der Lungenarterientransplantation (PAG)
- Vorbereitung des Empfängertieres:
- Legen Sie das betäubte Tier auf ein Korktablett mit der Schwanzseite zum Chirurgen.
- Führen Sie einen medianen Längsschnitt durch und verwenden Sie zwei Mini-Retraktoren, um den Bauch offen zu halten.
- Extrahieren Sie den Darm mit zwei Wattestäbchen und bedecken Sie ihn mit einer mit 39 ° C Kochsalzlösung getränkten Gaze, die die Visualisierung des retroperitonealen Bereichs unter Exposition der infrarenalen Bauchaorta (AA) ermöglicht.
HINWEIS: Während der Operation ist es wichtig, den Darm gelegentlich mit einer Spritze mit 39 ° C Kochsalzlösung zu befeuchten, um Hypothermie zu verhindern, ein kritischer Zustand, der bei Nagetieren häufig auftritt. - Streifen Sie das hintere parietale Peritoneum zwischen den beiden Nierenarterien und der Beckenverzweigung mit zwei Wattestäbchen ab und entfernen Sie das Fettgewebe um die infrarenale AA. Lassen Sie nur einen kleinen Teil Fett über dem AA, um die Handhabung auf dem Gefäß zu erleichtern.
- Trennen Sie den AA vom IVC. Um dieses Verfahren durchzuführen, passieren Sie zunächst eine gekrümmte Pinzette hinter der hinteren Aortenwand und öffnen Sie damit einen Durchgang zwischen AA und IVC. Verwenden Sie dann eine 2-0-Seidennaht, um eine Schlaufe um die AA zu erstellen, um das Gefäß anzuheben und das AA von IVC zu trennen. Ligatieren Sie jede Lendenarterie, die aus der infrarenalen AA entsteht, mit 6/0 Seidennaht und teilen Sie sie.
- Drehen Sie das Tier um 90 ° gegen den Uhrzeigersinn und legen Sie den Kopf auf die linke Seite des Bedieners. Die AA lagen nun horizontal im mikroskopischen Feld.
- Verwenden Sie zwei Yasargil-Clips, um das infrarenale AA zu klemmen und platzieren Sie sie in einem Abstand von 1,5 cm voneinander. Transektieren Sie die AA in der Mitte zwischen den beiden Clips.
- Bewässern Sie die beiden Enden der Gefäße mit Heparin (1 UI / ml) in Kochsalzlösung, um Gerinnsel zu entfernen. Entfernen Sie alle abenteuerlichen Trümmer aus den Gefäßen.
- PAG-Implantation:
- Platzieren Sie den PAG zwischen den beiden Enden, wobei das ventrikuläre Ende in Richtung des kranialen Teils des Tieres verläuft.
- Verwenden Sie eine 10-0-Polypropylennaht, um zwei markante Einzelstiche durchzuführen, die das PG mit dem AA verbinden. Führen Sie den Vorgang an beiden Enden des PAG durch, indem Sie die Naht auf gegenüberliegenden Seiten des Gefäßumfangs platzieren.
- Führen Sie eine End-to-End-Anastomose zwischen PAG und AA durch, beginnend mit dem distalen Ende. Verwenden Sie eines der beiden Enden der distalen Landmarknaht für die hintere Anastomose mit einer Empfänger-zu-Transplantat-Out-in/In-Out-Sequenz, um eine laufende Naht von etwa sechs Stichen durchzuführen.
- Sobald die Naht die proximale Landmarke erreicht hat, führen Sie eine doppelte halbe Kupplung durch, die durch einen quadratischen Knoten mit der Naht und einem der beiden Enden der proximalen Landmarknaht vervollständigt wird. Tragen Sie eine gummibeschlagene Mückenzange auf die Nähte auf, um Traktion zu gewährleisten.
- Führen Sie die gleiche Anastomose an der Vorderwand durch. Setzen Sie den gesamten Vorgang am proximalen Ende des PAG fort. Achten Sie besonders darauf, wenn Sie die proximale Anastomose durchführen, um zu vermeiden, dass eine Packungsbeilage in die Nahtlinie aufgenommen wird.
- Lassen Sie zuerst den distalen Clip los, um den PAG mit retrogradem Blut (Niederdruckfluss) füllen zu lassen, um die Anastomose zu überprüfen. Reparieren Sie alle Blutleckagen mit einer einzigen Naht. Sobald die distale Anastomose ausgewertet ist, führen Sie das gleiche Verfahren am proximalen Ende durch.
- Letzte Schritte der Operation am Empfänger:
- Beurteilen Sie die Durchgängigkeit des PAG und tragen Sie zwei Streifen Gelatineschwamm über die Nahtlinien auf beiden Seiten des PAG auf (falls erforderlich). Üben Sie sanften Druck für ein paar Sekunden mit zwei Wattestäbchen aus, um die Hämostase zu unterstützen.
- Versetzen Sie den Darm in die Bauchhöhle und schließen Sie die Wände mit einer 4/0 Polypropylen-Laufnaht.
5. Scheinoperatives Verfahren
- Führen Sie eine identische Vorbereitung des Tieres durch, wie zuvor für Empfängerratten dargestellt.
- Schneiden Sie die infranale AA, auf halbem Weg zwischen dem Ursprung der Nieren- und der Beckenarterien.
- Nähern Sie sich den beiden Enden der AA mit einer End-to-End-Anastomose, wie zuvor beschrieben. Entfernen Sie die beiden Clips und führen Sie ein genaues Hämostaseverfahren durch.
- Positionieren Sie den Darm neu und schließen Sie die Bauchdecke in Schichten, wie bei den Empfängertieren.
6. Postoperative Versorgung und Nachsorge
- Verabreichen Sie warme Kochsalzlösung (5 ml) in das Unterhautgewebe des Rückens des Tieres zur Hydratation. Legen Sie die Ratte unter eine Heizlampe und überwachen Sie sie visuell bis zum Erwachen, was normalerweise bis zu 5 Minuten dauert, nachdem die Narkose gestoppt wurde. Stellen Sie das Tier in einen Käfig mit einer Raumtemperatur von 22-24 °C mit sofortigem und uneingeschränktem Zugang zu Futter und Wasser.
- Intramuskuläres Tramadol (5 mg/kg) zur postoperativen Analgesie in den ersten 48 h nach der Operation zweimal täglich verabreichen. Danach überwachen Sie regelmäßig den Gesundheitszustand und das Körpergewicht des Empfängers täglich.
- Follow-up: Führen Sie während des Follow-ups Seriat-Ultraschalluntersuchungen nach einer Woche, einem Monat und zwei Monaten durch, um die PAG-Funktion zu bewerten. Messen Sie während dieser Studien den Gefäßdurchmesser, die maximale systolische Geschwindigkeit (PSV) und die enddiastolische Geschwindigkeit. Messen Sie diese Parameter innerhalb des PAG und auf der Ebene der proximalen und distalen AA.
- Euthanasieren Sie die Tiere nach zwei Monaten Follow-up durch Anwendung von CO2 für einige Minuten und explantieren Sie dann das PAG, das einer histopathologischen Analyse unterzogen wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Insgesamt wurden 39 erwachsene Lewis-Ratten in diese Studie eingeschlossen: 17 Tiere wurden als PAG-Spender, 17 Tiere als Empfänger und 5 als scheinoperierte (Kontrollgruppe) verwendet (Tabelle 1). Männliche Ratten waren 22 (56%) und weibliche 17 (44%); Letztere wurden nur in der Spendergruppe verwendet.
Während der Operation trat kein tödliches Ereignis mit 100% igem Überleben auf. Während der Nachuntersuchung hatten zwei Tiere der Transplantationsgruppe nach 12 bzw. 51 Tagen einen tödlichen Ausgang; die Überlebensrate am Ende der Studie betrug 91% (Tabelle 1).
Das Mediangewicht der Ratten betrug 387 g (Interquartilsbereich, IQR, 358-394 g) für die Empfängergruppe und 328 g (IQR=304-337 g) für die Spendergruppe. Eine Woche nach der Operation betrug das Mediangewicht 363 g (IQR = 350-376 g) mit einer Abnahme von 6% im Vergleich zum präoperativen Gewicht. Die Tiere gewannen ihr Gewicht innerhalb des ersten Monats der Nachbeobachtung wieder an Gewicht (Median 387 g, IQR 369-392 g), mit einem Endgewicht von 397 g nach zwei Monaten (IQR =391-402 g) (Abbildung 2).
Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug 62,5 Tage (IQR=60-68 Tage) in der Transplantationsgruppe und 62 Tage (IQR=61-67 Tage) in der scheinoperierten Gruppe (p=0,68).
Der präoperative PA-Mediandurchmesser in seiner nativen Position betrug 3,20 mm (IQR = 3,18-3,23 mm). Der mittlere Durchmesser des PAG betrug 4,03 mm (IQR=3,74-4,13 mm) nach einer Woche, 4,07 mm (IQR=3,80-4,28 mm) nach einem Monat und 4,27 mm (IQR=3,90-4,35 mm) nach zwei Monaten (Abbildung 3A). Dies war eine Steigerung von 25,9%, 27,2% bzw. 33,5% im Vergleich zum Durchmesser in der nativen Position. Die Zunahme des Durchmessers unterschied sich signifikant, wenn man den Wert in der nativen Position mit dem Wert nach einer Woche (p = 0,003) vergleicht, während in den folgenden Studien kein signifikanter Anstieg gefunden wurde. Der Aortendurchmesser in der scheinoperierten Gruppe betrug 1,41 mm (IQR = 1,35-1,62 mm) nach einer Woche und 1,41 mm (IQR = 1,29-1,70 mm) nach zwei Monaten. Der mediane PSV auf PAG-Ebene betrug 220,07 mm/s (IQR=210,43-246,41 mm/s) nach einer Woche, 430,88 mm/s (IQR=375,28-495,56 mm/s) nach einem Monat und 373,68 mm/s (IQR=305,78-429,81 mm/s) nach zwei Monaten. Im Vergleich zur scheinoperierten Gruppe wurde nach einer Woche ein signifikanter Unterschied in PSV gefunden (Median 419,12 mm/s, IQR=408,42-561,32 mm/s; p<0,001), während am Ende der Studie kein Unterschied gefunden wurde (392,92 mm/s, IQR=305,89-514,27 mm/s; p=0,5) (Abbildung 3B).
Am Ende der Studie zeigte die histologische Analyse keine Anzeichen einer Endothelthrombose und die Wandverkalkung war in den meisten Fällen nicht signifikant (Abbildung 4).
Abbildung 1: Repräsentatives Bild des Ross-Vorgangs. Das Foto zeigt die Phasen der Ross-Operation. (A) Aortenklappe und Wurzelexplant; (B) Autotransplantattransposition der Lungenarterie in der Aortenposition; (C) Autotransplantatersatz der Lungenarterie durch ein Homotransplantat. A: Aortenklappe und Wurzel; H: Homograft; P: Pulmonalklappe und Wurzel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zeitlicher Verlauf des Körpergewichts in der Transplantationsgruppe. Die Grafik zeigt den Verlauf des Gewichts der Ratte in der Transplantationsgruppe über die Zeit. Die Werte werden als Median- und Interquartilsbereich ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Variation des Durchmessers und der maximalen systolischen Geschwindigkeit in das pulmonale Arterientransplantat. Die Graphen zeigen die Variation des Durchmessers (A) und der maximalen systolischen Geschwindigkeit (B) innerhalb des Lungenarterientransplantats während der ultraschallsonographischen Auswertungen des Seriats. Die Werte werden als Median- und Interquartilsbereich ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Mikroskopische Auswertung des PAG. Das Bild zeigt das PAG nach explantiert (A). B) Röntgenuntersuchung; (C) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung, ursprüngliche Vergrößerung 12,5-fach. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| VARIABLE | VERPFLANZEN | GELDGEBER | SCHEIN-OPERIERT | GESAMT |
| Anzahl der Veranstaltungen | 17 | 17 | 5 | 39 |
| Tödliche Ereignisse in der Operation | 0 | // | 0 | 0 |
| Tödliche Ereignisse während der Nachbeobachtung (%) | 2 | // | 0 | 2 (91) |
| Gewicht bei der Operation* | 387 (358-394) | 327,5 (303-337) | 389 (321-404) |
Tabelle 1: Merkmale und Ergebnisse der Studie. *Die Werte werden als Median- und Interquartilsbereich ausgedrückt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der Aortenklappenersatz mit der autologen Lungenwurzel (Ross-Operation) stellt aufgrund des günstigen Profils und des potenziellen Wachstums des Autotransplantats10 eine attraktive Option für die Reparatur der angeborenen Aortenklappenstenose dar. Die Haupteinschränkung dieses Verfahrens ist die mögliche Dilatation der Aorten-Neoklappe, die für die Entwicklung einer langfristigen Regurgitation prädisponiert. Die Möglichkeit, die Veränderungen an der Lungenarterie nach Exposition gegenüber systemischem Druck zu charakterisieren, könnte die Grundlage für das Verständnis der Ursachen des Versagens des pulmonalen Autotransplantats darstellen. Aus diesem Grund haben wir ein experimentelles Modell der syngenen PAG-Implantation in einer systemischen Position in einem Nagetiermodell entwickelt.
Die berichtete Operationstechnik ist sicher, effektiv und reproduzierbar. Die geringe Größe der verwendeten Tiere vereinfacht das chirurgische und postoperative Management. Dies ermöglichte es uns, ein nützliches Modell mit begrenzten Material- und Tierkosten zu erhalten. Lewis-Ratten wurden ausgewählt, weil diese Ratten als Inzuchtstamm isogen sind und über 99% ihrer Allele fixiert sind. Damit sind sie ein geeignetes Modell für die Untersuchung der Transplantation von Pulmonalklappen zwischen Tieren. Wir haben uns entschieden, einen zweimonatigen Endpunkt für die Studie festzulegen, da Literaturdaten ein Verhältnis von 1:11 zwischen menschlichen und Rattentagen zeigen11. Daher können wir davon ausgehen, dass unsere Nachbeobachtungszeit etwa fünf Jahren entsprechen würde, was es uns ermöglicht, die PAG-Anpassung mittel- bis langfristig zu bewerten.
Unsere ersten Ergebnisse zeigten einen schnellen Anstieg des PAG-Durchmessers und eine Abnahme des PVS, das innerhalb der ersten Woche nach der Implantation auf seinem Niveau gemessen wurde. Anschließend wurde ein partielles Plateau der Durchmesserzunahme beobachtet. Wir können spekulieren, dass die Abnahme des PSV, die in der kurzfristigen Periode beobachtet wird, mit dem erhöhten PAG-Durchmesser zusammenhängt, was zu einer Verlangsamung des Blutflusses in das PAG selbst führt.
Weitere Studien, die darauf abzielen, die PAG-Modifikation nach kürzeren Follow-up-Endpunkten in einer systemischen Position zu indagieren, werden dazu beitragen, die Entwicklung dieser Anpassung im Laufe der Zeit zu klären. Eine mögliche zukünftige Entwicklung dieses Modells unter Verwendung verschiedener Strategien zur Modulation der PAG-Fehlanpassung könnte möglicherweise seine Dilatation verhindern und somit die Ergebnisse nach der Ross-Intervention verbessern. Diese Strategien können eine pharmakologische Behandlung sein, wie z.B. Druckkontrolle (d.h. unter Verwendung von ACE-Hemmern oder Angiotensin-II-Rezeptorblockern), antioxidative Therapien, oder eine mechanische Eindämmung der PAG-Dilatation mit einer externen Verstärkung (wie kürzlich von einigen Autoren vorgeschlagen12).
Einige kritische Schritte im Verfahren sollten mit besonderer Aufmerksamkeit durchgeführt werden. Erstens ist es von grundlegender Bedeutung, bei der Entnahme der Lungenarterie die richtige Menge an rechtem Ventrikelmuskel einzubeziehen. In der Tat, wenn zu viel Muskelgewebe erhalten bleibt, erhöht sich das Risiko des Auslaufens der Anastomose, während eine unzureichende Muskelmenge für schädigende Blättchen der Klappe prädisponieren könnte. Bei der Durchführung der proximalen End-to-End-Anastomose zwischen PA und AA sollte besonders darauf geachtet werden, die Packungsbeilagen der Klappe nicht einzubeziehen, um eine Beeinträchtigung ihres Bewegungsumfangs zu vermeiden. Schließlich ist eine ausreichende Hämostase von grundlegender Bedeutung, um einen übermäßigen Blutverlust zu vermeiden, der den postoperativen Verlauf beeinträchtigen könnte.
Eine Gewichtsreduktion von bis zu 6% wird während der Nachuntersuchung als akzeptabel angesehen. Die Tiere sollten jedoch innerhalb des ersten Monats der Nachbeobachtung ihr Ausgangsgewicht wiedererlangen und danach ihr Gewicht weiter erhöhen. Wenn ein Nichterreichen des Ausgangsgewichts mit dem Nachweis eines Aufwärtstrends verbunden ist, kann dies auch als Index des Tierwohls angesehen werden. Auf der anderen Seite sollte jede Gewichtsreduktion von mehr als 6% und jedes Versäumnis, das Ausgangsgewicht nach einem Monat mit einem Abwärtstrend zu erreichen, Bedenken hinsichtlich möglicher schlechter Bedingungen der Tiere aufkommen lassen.
Der wichtigste technische Vorschlag für Forscher, die sich diesem Modell nähern, ist die Verwendung von kontinuierlichem Nähen zur Durchführung der End-to-End-Anastomose. Während Mikrochirurgie-Lehrbücher vorschlagen, separate Stiche für diese Art von Anastomose zu verwenden, bevorzugen wir kontinuierliches Nähen, weil es die Lungenwurzel besser strafft. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass es auf diese Weise einfacher ist, die potenzielle Diskrepanz mit der Empfängeraorta zu reduzieren, die trotz der Verwendung eines kleineren Tieres für die Lungenwurzelernte immer noch vorhanden ist.
Andere Tiermodelle zur Untersuchung der Lungenwurzeldrucküberlastung wurden bereits in der aktuellen Literatur beschrieben. Dabei handelt es sich in der Regel um PA-Banding13. Trotz der effektiven Erhöhung des vorgeschalteten Drucks bilden diese Modelle ein Ross-Verfahren nicht vollständig nach. Tatsächlich ist die erste Einschränkung eine hohe Variabilität der Drucküberlastung, die davon abhängt, wie dicht die Bandage im Vergleich zum PA-Durchmesser ist. Aus diesen Gründen spiegelt die Lungenüberlastung möglicherweise nicht immer den tatsächlichen systemischen Druck wider. Die Erhaltung der Lungenwurzel in ihrer nativen Position stellt die zweite Einschränkung von PA-Banding-Modellen dar. Bei einem Ross-Verfahren verliert die PA alle vaskulären und nervösen Verbindungen, was ihre weitere Anpassung an systemische Belastungen beeinflussen kann.
Die wissenschaftliche Gemeinschaft hat auch bereits einige Tiermodelle der heterotopen Transposition der PA in einer systemischen Position beschrieben. Bei all diesen Modellen werden jedoch großformatige Tiere wie Lämmer oder Schafe verwendet14,15. Diese Tiere könnten zweifellos unter einigen Aspekten den chirurgischen Eingriff vereinfachen, indem sie die Möglichkeit bieten, ein tatsächliches Ross-Verfahren durchzuführen. Die Notwendigkeit eines kardiopulmonalen Bypasses sowie der Bedarf an mehr Menschen, die an der chirurgischen und postoperativen Behandlung beteiligt sind, erhöht jedoch die Kosten enorm und schränkt so den Einsatz dieses Modells in großem Maßstab ein. Darüber hinaus würden Kleintiermodelle, wie Ratten, es ermöglichen, eine Vielzahl von Casuistik durchzuführen, wodurch die Variabilität reduziert und unterschiedliche Zeitendpunkte sowie die Möglichkeit, mehrere Gruppen zu vergleichen, ermöglicht werden.
Obwohl es die Möglichkeit bietet, die Modifikation der PA-Wurzel auf systemische Belastungen wie bei der Ross-Operation zu bewerten, hat dieses Modell einige Einschränkungen. Die Haupteinschränkung ist die Unmöglichkeit, eine tatsächliche Ross-Operation mit Koronararterienablösung und Reimplantation durchzuführen. Für unsere Zwecke war dies jedoch nur eine geringfügige Einschränkung, da sich die Studie auf die Lungenwand konzentrierte. Der Druck in der infrarenalen Bauchaorta unterscheidet sich von dem in der aufsteigenden Aorta, wodurch der Vergleich mit der Ross-Operation in Bezug auf die Bewegung der Klappenblättchen eingeschränkt wird; Unser Hauptaugenmerk lag jedoch wieder auf der PA-Wurzel als Primum-Movens des PAG-Ausfalls. Darüber hinaus kann die Verwendung von Nagetieren einige Einschränkungen im Zusammenhang mit einer anderen systemischen Druckskala im Vergleich zu großen Tieren aufweisen. Dieser Unterschied ist jedoch proportional zu den Drücken, denen die native Wurzel ausgesetzt ist.
Zusammenfassend zeigte die aktuelle Studie, dass eine systemisch platzierte syngene PAG-Implantation in ein Nagetiermodell eine einfache und praktikable Plattform für die Entwicklung und Bewertung neuartiger Operationstechniken und medikamentöser Therapien darstellt, um die Ergebnisse der Ross-Operation weiter zu verbessern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Studie wurde aus dem integrierten Budget für ressortübergreifende Forschung (BIRD) 2019 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Monico SpA | AIC 030805105 | Two bottles of 100 mL. The cold one (4°C) for flushing the harvesting organ; the warm one (39°C) for moistening, and rehydration of the recipient |
| 7.5% Povidone-Iodine | B Braun | AIC 032151211 | |
| Barraquer | Aesculap | FD 232R | Straight micro needle holder for the vascular anastomoses |
| Castroviejo needle holder | Not available | J 4065 | To close the animal |
| Clip applying forceps | Rudolf Medical | RU 3994-05 | For clip application |
| Cotton swabs | Johnson & Johnson Medical SpA | N/A | Supermarket product. Sterilized |
| Curved micro jeweller forceps | Rudolf Medical | RU 4240-06 | Used to pass sutures underneath the vases. |
| Depilatory cream | RB healthcare | N/A | Supermarket product |
| Electrocautery machine | LED SpA | Surton 200 | |
| Fine scissors | Rudolf Medical | RU 2422-11 | For opening the abdomen (recipient) |
| Fine-tip curved Vannas micro scissors | Aesculap | OC 497R | Only for preparing the pulmonary root, cut the lumbar vases and the 10/0 Prolene |
| Fluovac Isoflurane/Halotane Scavanger unit | Harvard Apparatus Ltd | K 017041 | Complete of anesthesia machine, anesthesia tubing, induction chamber and scavenger unit with absorbable filter |
| Gentamycin | MSD Italia Srl | AIC 020891014 | Antibiotic. Single dose, 5 mg/kg intramuscular, administered during surgery |
| Heparin | Pharmatex Italia Srl | AIC 034692044 | 500 IU into the recipient abdominal vena cava |
| I.V. Catheter | Smiths Medical Ltd | 4036 | 20G |
| Insulin Syringe, 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | To inject heparin in the harvesting animal and to flush the sectioned aorta in the recipient |
| Jeweler bipolar forceps | GIMA SpA | 30665 | 0.25 mm tip. For electrocautery of very small vases |
| Lewis rats (LEW/HanHsd) | Envigo RMS SRL, San Pietro al Natisone, Udine, Italy | 86104M | Male or female, weighing 200-250 g (pulmonary root harvesting animals) and 320-400 g (recipients) |
| Micro-Mosquito | Rudolf Medical | RU 3121-10 | In number of four, with tips covered with silicon tubing. To keep in traction the Prolene suture during anastomosis |
| Operating microscope | Leica Microsystems | M 400-E | Used with 6x, 10x and 16x in-procedure interchangeable magnifications |
| Perma-Hand silk 2-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | C026D | To lift the aorta |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Prolene 10-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | W2790 | Very fine non-absorbable suture, with a BV75-3 round bodied needle, for the vascular anastomoses |
| Retractors | Not any | N/A | Two home-made retractors |
| Ring tip micro forceps | Rudolf Medical | RU 4079-14 | For delicate manipulation |
| Sevoflurane | AbbVie Srl | AIC 031841036 | Mixed with oxygen, for inhalatory anesthesia |
| Spring type micro scissors | Rudolf Medical | RU 2380-14 | Straight; 14 cm long |
| Standard aneurysm clips | Rudolf Medical | RU 3980-12 | Two clips (7.5 mm; 180 g; 1.77 N) to close the aorta |
| Sterile gauze of non-woven fabric material | Luigi Salvadori SpA | 26161V | 7.5x7.5 cm, four layers |
| Straight Doyen scissors | Rudolf Medical | RU/1428-16 | For use to the donor |
| Straight micro jeweller forceps | Rudolf Medical | RU 4240-04 | 10.5 cm long. Used throughout the anastomosis |
| Syringes | Artsana SpA | N/A | 20 mL (for the harvesting animal) and 5 mL (for the recipient). For saline flushing and dipping |
| TiCron 4-0 | Covidien | CV-331 | For closing muscles and skin |
| Tissue forceps V. Mueller | McKesson | CH 6950-009 | Used for skin and muscles |
| Tramadol | SALF SpA | AIC 044718029 | Analgesic. Single dose, 5 mg/kg intramuscular |
| Virgin silk 8-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | W818 | For arterial branch ligation |
References
- Botto, L. D., Correa, A., Erickson, J. D. Racial and temporal variations in the prevalence of heart defects. Pediatrics. 107 (3), 32 (2001).
- Vergnat, M., et al. Aortic stenosis of the neonate: A single-center experience. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 157 (1), 318-326 (2019).
- Hraška, V., et al. The long-term outcome of open valvotomy for critical aortic stenosis in neonates. The Annals of Thoracic Surgery. 94 (5), 1519-1526 (2012).
- Kaza, A. K., Pigula, F. A. Are bioprosthetic valves appropriate for aortic valve replacement in young patients. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. 19 (1), 63-67 (2016).
- Myers, P. O., et al. Outcomes after mechanical aortic valve replacement in children and young adults with congenital heart disease. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 157 (1), 329-340 (2019).
- Donald, J. S., et al. Ross operation in children: 23-year experience from a single institution. The Annals of thoracic surgery. 109 (4), 1251-1259 (2020).
- Khwaja, S., Nigro, J. J., Starnes, V. A. The Ross procedure is an ideal aortic valve replacement operation for the teen patient. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. , 173-175 (2005).
- Elkins, R. C., Lane, M. M., McCue, C. Ross operation in children: late results. The Journal of Heart Valve Disease. 10 (6), 736-741 (2001).
- Chambers, J. C., Somerville, J., Stone, S., Ross, D. N. Pulmonary autograft procedure for aortic valve disease: long-term results of the pioneer series. Circulation. 96 (7), 2206-2214 (1997).
- Mazine, A., et al. Ross procedure in adults for cardiologists and cardiac surgeons: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (22), 2761-2777 (2018).
- Sengupta, P. The laboratory rat: Relating its age with humans. International Journal of Preventive Medicine. 4 (6), 624-630 (2013).
- Ashfaq, A., Leeds, H., Shen, I., Muralidaran, A. Reinforced ross operation and intermediate to long term follow up. Journal of Thoracic Disease. 12 (3), 1219-1223 (2020).
- Vida, V. L., et al. Age is a risk factor for maladaptive changes of the pulmonary root in rats exposed to increased pressure loading. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 21 (3), 199-205 (2012).
- Nappi, F., et al. An experimental model of the Ross operation: Development of resorbable reinforcements for pulmonary autografts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 149 (4), 1134-1142 (2015).
- Vanderveken, E., et al. Mechano-biological adaptation of the pulmonary artery exposed to systemic conditions. Scientific Reports. 10 (1), 2724 (2020).
