Summary
Questo articolo fornisce protocolli dettagliati per infliggere lesioni cerebrali traumatiche penetranti (PTBI) a Drosophila adulta ed esaminare la neurogenesi risultante.
Abstract
I meccanismi molecolari e cellulari alla base della neurogenesi in risposta a malattie o lesioni non sono ben compresi. Tuttavia, la comprensione di questi meccanismi è fondamentale per lo sviluppo di terapie rigenerative neurali. Drosophila melanogaster è un modello leader per gli studi sullo sviluppo neurale, ma storicamente non è stato sfruttato per studiare la rigenerazione del cervello adulto. Ciò è dovuto principalmente al fatto che il cervello adulto mostra un'attività mitotica molto bassa. Tuttavia, la penetrazione della lesione cerebrale traumatica (PTBI) al cervello centrale della Drosophila adulta innesca la generazione di nuovi neuroni e nuova glia. I potenti strumenti genetici disponibili in Drosophila combinati con il semplice ma rigoroso protocollo di lesione qui descritto ora rendono il cervello adulto di Drosophila un modello robusto per la ricerca sulla rigenerazione neurale. Qui sono fornite istruzioni dettagliate per (1) lesioni penetranti al cervello centrale adulto e (2) dissezione, immunoistochimica e imaging post-lesione. Questi protocolli producono risultati altamente riproducibili e faciliteranno ulteriori studi per sezionare i meccanismi alla base della rigenerazione neurale.
Introduction
I danni al cervello e al sistema nervoso sono una delle principali cause di morte e disabilità in tutto il mondo. Circa 1,5 milioni di americani soffrono di lesioni cerebrali traumatiche (TBI) ogni anno1, mentre si stima che 6 milioni di individui solo negli Stati Uniti soffrano di malattie neurodegenerative, come il morbo di Parkinson e il morbo di Alzheimer2. Sia la malattia che le lesioni al cervello possono causare degenerazione neurale, portando a difetti sensoriali, cognitivi e motori3. Lo sviluppo di strategie terapeutiche per la riparazione del cervello umano è stato difficile a causa della complessa fisiologia del cervello. Organismi modello come Drosophila melanogaster forniscono un sistema semplice per identificare i meccanismi fondamentali alla base della neurodegenerazione e potenziali bersagli terapeutici4.
Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster è stato un potente organismo modello per più di un secolo, facendo progredire i campi della genetica, della biologia dello sviluppo e delle neuroscienze5,6. Il cervello di Drosophila comprende solo circa 90.000 neuroni7, un milione di volte in meno rispetto al cervello umano medio8, eppure hanno molte somiglianze. Sia il cervello umano che quello delle mosche utilizzano i neurotrasmettitori GABA, glutammato, acetilcolina e le ammine biogeniche dopamina e serotonina9. Anche la drosofilia e i neuroni umani funzionano in modo simile, con un'architettura sinaptica condivisa e tipi di cellule neurali analoghi10. Le dimensioni più piccole del cervello di Drosophila e la disponibilità di tecniche genetiche avanzate, in combinazione con la conservazione dei meccanismi molecolari, cellulari e fisiologici tra Drosophila e mammiferi, consente ai ricercatori di Drosophila di porre domande che sono poco pratiche o difficili da rispondere nei modelli di mammiferi.
La nostra attuale comprensione della neurogenesi adulta in Drosophila, sia durante l'omeostasi che dopo la lesione, rimane limitata. Si sa di più sulla neurogenesi durante il normale sviluppo. Ad esempio, i neuroni e la glia vengono creati durante lo sviluppo da cellule precursori, chiamate neuroblasti10,11. Almeno tre diversi tipi di neuroblasti sono stati distinti nel cervello centrale. Entrambi i neuroblasti di lignaggio di tipo I e di tipo II escono dal ciclo cellulare ~ 20-30 ore dopo la formazione del puparium12. Al contrario, i neuroblasti del corpo dei funghi sono gli ultimi a terminare la divisione cellulare e lo fanno tramite apoptosi dipendente da Reaper ~ 85-90 ore dopo la formazione del puparium13. Dopo l'eclosione, il cervello adulto di Drosophila ha poche cellule in divisione (~ 1 cellula / cervello), prevalentemente glia14. I lobi ottici adulti possiedono neuroblasti a ciclo lento capaci di neurogenesi15, mentre il cervello centrale adulto non ha neuroblasti noti. La scarsità di progenitori neurali e la proliferazione cellulare limitata assomigliano fortemente alla situazione nel cervello dei mammiferi adulti, sottolineando la potenziale rilevanza dei meccanismi della neurogenesi adulta in Drosophila per l'uomo.
La scoperta di bassi livelli di neurogenesi adulta nei lobi ottici di Drosophila adulti dopo la lesione15 ha portato all'ipotesi che anche il cervello centrale di Drosophila adulto potrebbe essere in grado di neurogenesi adulta16. Questo protocollo descrive la creazione di un modello rigoroso e riproducibile di lesione cerebrale centrale nella Drosophila adulta che può essere utilizzato per studiare la neurogenesi nel cervello centrale adulto. Date le somiglianze tra l'architettura e la funzione del cervello umano e di Drosophila, queste scoperte potrebbero portare all'identificazione di bersagli critici per la neurogenesi terapeutica nel cervello umano ferito e malato.
Protocol
Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali di UW-Madison.
1. Generazione di Drosophila adulta per PTBI
- Per la croce standard, posizionare 20 vergine y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL417 femmine adulte e 10 anni[1] w[1]17 maschi adulti volano insieme in fiale (vedi Tabella dei materiali) contenenti cibo. Per avere un gran numero di prole sincrona, imposta 10-20 croci contemporaneamente. La croce standard dà origine alla progenie F1 del genotipo: y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+.
- Posizionare i flaconcini a 25 °C per l'accoppiamento e la deposizione delle uova. Per massimizzare la progenie, trasferire i genitori in nuovi flaconcini ogni 2-4 giorni, mantenendo i flaconcini precedenti a 25 °C. Scartare ogni flaconcino 18 giorni dopo che i genitori sono stati inseriti per la prima volta in esso per garantire che non vi sia alcuna progenie F2.
NOTA: 3 set di prole ("covate") possono essere generati da ciascun set di genitori. - Controlla dopo ~ 10 giorni, quando la progenie di F1 inizierà a chiudersi.
- Posizionare i flaconcini a 25 °C per l'accoppiamento e la deposizione delle uova. Per massimizzare la progenie, trasferire i genitori in nuovi flaconcini ogni 2-4 giorni, mantenendo i flaconcini precedenti a 25 °C. Scartare ogni flaconcino 18 giorni dopo che i genitori sono stati inseriti per la prima volta in esso per garantire che non vi sia alcuna progenie F2.
- Per gli studi di lignaggio, utilizzare F1 perma-twin males15 di genotipo: w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; tub-GAL80ts/act-GAL4 UAS-flp. Per coerenza, fai questa croce nella stessa direzione ogni volta.
- Per generare maschi perma-gemelli, posizionare 20 w vergini; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir; tub-GAL80ts/TM6B femmine e 10 w; FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; act-GAL4 UAS-flp/TM6B15 maschi adulti insieme in flaconcini contenenti cibo.
- Posizionare i flaconcini a 17 °C per l'accoppiamento e la deposizione delle uova. Trasferire i genitori in flaconcini di cibo nuovo ogni 7 giorni, mantenendo tutti i flaconcini a 17 °C. Scartare ogni flaconcino 35 giorni dopo che i genitori sono stati inseriti per la prima volta in esso per assicurarsi che non ci siano progenie F2.
- Controlla dopo ~ 21 giorni, quando la progenie di F1 inizierà a chiudersi.
2. Penetrazione della lesione cerebrale traumatica (PTBI; Figura 1)
- Ordina le mosche F1 appena eclosed. Seleziona i giovani maschi entro 6 ore dopo l'eclosione. Metti questi maschi in fiale pulite contenenti cibo, con 40 o meno mosche per fiala.
NOTA: Questo è più facilmente realizzabile a metà mattinata anestetizzando le mosche sul cuscinetto di CO2 e identificando i maschi adulti che hanno ancora il meconio (visibile come una macchia verdastra scura attraverso la parete addominale) nelle loro viscere. - Pre-alimentazione con 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) (vedere Tabella dei materiali) per 6 ore prima della lesione se si prevede di etichettare le cellule in divisione con EdU. Vedere il passaggio 3 per i dettagli.
- Disinfettare i perni Minutien (vedi Tabella dei materiali) per almeno 5 minuti posizionando ~ 100 pin in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml riempito con etanolo al 70%.
- Disinfettare il tampone CO2 e un pennello spruzzando il 70% di etanolo e asciugare con un tessuto pulito privo di lanugine. Una volta che gli strumenti sono puliti e asciutti, trasferire 40 o meno maschi F1 ordinati sul pad pulito.
- Separa i maschi di F1 in 2 gruppi sul fly pad. Un gruppo servirà da controllo, mosche illese. Il secondo gruppo sperimentale sarà sottoposto a PTBI.
- Usando la pinza, estrarre 4-5 nuovi perni Minutien dal tubo della microcentrifuga e posizionarli vicino al bordo del cuscinetto CO2 . Sotto l'ambito di dissezione, scegli un perno Minutien dritto con una punta affilata.
NOTA: l'utilizzo di un singolo pin Minutien per un esperimento ridurrà la variabilità. Riutilizzare gli spilli affilati. Posizionare i perni danneggiati o smussati in un tubo microcentrifuga separato da 1,5 ml contenente il 70% di etanolo per uno smaltimento sicuro. - Se si lavora con mosche dalla croce standard, accendere la lampada a diodi emettitori di luce (LED) stereomicroscopica dotata degli appositi filtri di eccitazione ed emissione per la proteina di fluorescenza verde (GFP). Ciò consente l'eccitazione a 440-460 nM e consente la visualizzazione di 500-560 nM.
NOTA: Con questa lampada e questo set di filtri, i corpi cellulari del corpo del fungo fluoresceranno di verde attraverso la cuticola della testa (Figura 1C). Per le mosche gemelle perma o le mosche di altri genotipi, un illuminatore a luce bianca standard per lo stereomicroscopio può essere utilizzato per visualizzare i punti di riferimento sulla cuticola della testa per indirizzare la lesione al corpo del fungo (Figura 1C). - Usa la pinza per raccogliere e tenere la spilla Minutien selezionata in una mano (per i destrimani, di solito è la mano destra) e il pennello nell'altra mano (di solito sinistra). Scegli una mosca dal gruppo sperimentale e posiziona la mosca in modo tale da avere una vista dorsale della capsula della testa con la testa della mosca a destra. Posizionare il pennello sulla parte anteriore del torace dorsale e spingere delicatamente verso il basso per stabilizzare la mosca.
- Punta la punta del perno Minutien verso i corpi cellulari del corpo del fungo sul lato destro della testa e penetra nella capsula della testa. Se si utilizzano punti di riferimento, prendere di mira la cuticola della testa dorsale tra gli ocelli e il bordo dorsale dell'occhio (Figura 1).
- Dopo aver completato l'infortunio, utilizzare il pennello per spingere delicatamente la testa fuori dal perno Minutien.
- Se si utilizza il cervello per RNA-Seq o qRT-PCR, fare una seconda lesione sul lato sinistro della testa.
- Ripeti i passaggi 2.8-2.10 per ferire tutte le mosche del gruppo sperimentale.
- Una volta che tutte le mosche sono state ferite, posizionare il controllo e le mosche ferite in flaconcini separati etichettati contenenti cibo. Appoggiare le fiale orizzontalmente (cioè sui lati) mentre le mosche si riprendono dall'anestesia e durante il successivo invecchiamento per evitare che le mosche rimangano intrappolate nel cibo.
- Posiziona le mosche incrociate standard a 25 ° C e le mosche gemelle perma a 30 ° C fino all'età.
- Per le mosche di età superiore a 24 ore, metterle su cibo pulito ogni 1-2 giorni.
3. Etichettatura EdU
- Preparare una scorta di 10 mM 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) in dimetilsolfossido (DMSO). Questo può essere conservato a -20 °C per un massimo di 12 mesi.
- Preparare 200 μL di 50 μM EdU in 10% di saccarosio. Pre-alimentazione vola con EdU per 6 ore prima di PTBI.
- Introdurre 200 μL di EdU da 50 μM in saccarosio al 10% su una carta da filtro rotonda di grado 3 da 23 mm (vedere Tabella dei materiali) in un flaconcino altrimenti vuoto.
- Metti le mosche nel flaconcino. Quindi sigillare il flaconcino con un tappo di cotone.
- Posare il flaconcino orizzontalmente in un incubatore umidificato a 25 °C per 6 ore.
- Eseguire PTBI come descritto nei passaggi 2.3-2.10.
- Riposizionare le mosche nel flaconcino contenente EdU. Sigillare il flaconcino con un tappo di cotone.
- Posare il flaconcino orizzontalmente in un incubatore umidificato a 25 °C per un massimo di 24 ore. Seguire uno dei passaggi descritti di seguito (passaggi 3.8.1-3.8.3).
- Sezionare e fissare il cervello come descritto nella fase 4 utilizzando fissativo, tampone di lavaggio e tampone di blocco senza azide e con la reazione di rilevamento EdU effettuata prima della colorazione degli anticorpi.
- Trasferire le mosche in un flaconcino pulito contenente una nuova carta da filtro e 200 μL di EdU da 50 μM in saccarosio al 10%. Stendere il flaconcino orizzontalmente in un incubatore a 25 °C. Ripetere ogni 24 ore durante la durata dell'etichettatura. Quindi, sezionare e fissare i cervelli come descritto nella fase 4 utilizzando tamponi senza azide con la reazione di rilevamento EdU effettuata prima della colorazione degli anticorpi.
- Per l'etichetta pulse-chase con EdU, alimentare EdU per il periodo di impulso, trasferire le mosche ogni 24 ore in una fiala pulita contenente una nuova carta da filtro e 200 μL di 50 μM in 10% di saccarosio. Dopo il periodo di impulso (ad esempio, 4 giorni), trasferire le mosche in una fiala contenente cibo standard Drosophila. Posizionare il flaconcino su un lato in un'incubatrice a 25 °C per altri 3 giorni. Quindi, sezionare e fissare i cervelli come descritto nella fase 4 utilizzando tamponi senza azide con la reazione di rilevamento EdU effettuata prima della colorazione degli anticorpi.
4. Dissezione, immunoistochimica e montaggio
- Preparare tubi microcentrifuga da 1,5 mL con 100 μL di fissativo: 4% formaldeide in PEM (100 mM piperazina-N,N'-bis(acido 2-etansolfonico) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7,0) (vedi Tabella dei materiali) e posto su ghiaccio.
NOTA: Fino a 20 cervelli di un singolo genotipo e condizione possono essere elaborati in un singolo tubo. - Preparare una piastra di dissezione con una piccola piscina (~100 μL) di etanolo al 70% e tre piccole piscine di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 100 mM di K2HPO4, 140 mM di NaCl, pH 7,0).
- Anestetizzare ~ 10 mosche di controllo o sperimentali su un cuscinetto di CO2 che è stato disinfettato con il 70% di etanolo.
- Separare la testa dal tronco di ogni mosca usando un bisturi.
- Raccogliere le teste con un pennello bagnato al 70% di etanolo e posizionare le teste per 2-5 minuti nella piscina di etanolo sulla piastra di dissezione.
NOTA: Questo disidrata leggermente il cervello e li rende più facili da sezionare lontano dalla cuticola della testa. - Trasferire le testine in un pool di ~ 100 μL di PBS e sezionare il cervello, spostando ogni cervello in un pool pulito di ~ 100 μL di PBS. Esegui questo utilizzando due paia di pinze Watchmakers per aprire la parte posteriore della cuticola della testa e tenendo la cuticola con un paio di pinze mentre fai uscire delicatamente il cervello dalla cuticola usando la punta chiusa del secondo paio di pinze.
- Trasferire i cervelli sezionati in un tubo di microcentrifuga contenente 100 μL della soluzione fissante utilizzando un pipettor P200 dotato di una punta di plastica che è stata tagliata e smussata per consentire l'ingresso del cervello.
- Fissare per 20-25 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione la correzione con una pipetta P200 o di vetro.
- Lavare il cervello fisso quattro volte con 1 ml di 'PT' (PBS più 0,1% Triton X-100), permettendo al cervello di sistemarsi per diversi minuti tra ogni lavaggio.
NOTA: Se i cervelli non si depositano rapidamente tra i lavaggi, è probabile che abbiano ancora grasso corpo e / o trachea attaccata. - Campioni di blocco in 1 mL di PBS più 0,1% Triton X-100 e 2% di albumina sierica bovina (PBT) per ~ 1 ora a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione bloccante e incubare i campioni con 100 μL di soluzione anticorpale primaria durante la notte a 4 °C in PBT. Gli anticorpi primari utilizzati in questo studio sono anti-PH3 di coniglio (1:500) e anti-Fasiclin II di topo (1:20) (vedere Tabella dei materiali).
- Lavare i campioni cinque volte con 1 ml di PT, consentendo al cervello di depositarsi per diversi minuti tra un lavaggio e l'altro.
- Rimuovere il lavaggio finale e incubare in 100 μL di soluzione anticorpale secondaria durante la notte a 4 °C. Gli anticorpi secondari utilizzati qui sono anti-coniglio 568 (1:400) e anti-topo Cy5 (1:100) (vedi Tabella dei materiali).
- Lavare i campioni cinque volte con 1 ml di PT, consentendo al cervello di depositarsi per diversi minuti tra un lavaggio e l'altro. Durante il lavaggio finale, aggiungere 4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato (DAPI; 1:100 di una soluzione da 10 μM) per 10 minuti per macchiare i nuclei. Rimuovere il lavaggio, lasciando 50-100 μL in ogni tubo.
- Preparare i vetrini per microscopio posizionando una singola etichetta di rinforzo autoadesiva al centro di ogni vetrino e una goccia da 50 μL di supporti di montaggio anti-dissolvenza al centro di ogni etichetta (vedere Tabella dei materiali). L'etichetta di rinforzo tiene il coperchio leggermente sopra le diapositive e impedisce ai cervelli montati di diventare eccessivamente appiattiti.
- Trasferire con cura il cervello da ogni tubo di microcentrifuga a un vetrino preparato con il minor buffer di lavaggio possibile utilizzando un P200 dotato di una punta di plastica tagliata e smussata. Fino a 10 cervelli possono essere montati su una singola diapositiva.
- Utilizzare una pinza per riposizionare delicatamente il cervello prima di posizionare una copertina su ogni diapositiva e sigillare la diapositiva con lo smalto per unghie. Orientare il cervello con il lato posteriore verso l'alto o il lato anteriore verso l'alto, ma non dovrebbe toccarsi l'un l'altro.
NOTA: Poiché è difficile ottenere immagini confocali di alta qualità attraverso un intero cervello, alcuni cervelli dovrebbero essere montati in ogni orientamento. - Conservare i vetrini preparati piatti e al buio a 4 °C fino all'imaging. Per la conservazione a lungo termine (fino a 1 anno), i vetrini possono essere conservati a -20 °C.
5. Imaging confocale
NOTA: Immagini cerebrali utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con laser di eccitazione e cubi di filtro di emissione appropriati per DAPI e anticorpi secondari fluorescenti (cioè 405 nm, 488 nm e 568 nm, 633 nm, rispettivamente).
- Accendi la potenza del microscopio, dei laser, del controller e del computer.
- Aprire il software di acquisizione.
- Nella modalità di acquisizione, selezionare fino a quattro canali e impostare il parametro per la scansione sequenziale dei canali desiderati. Aumentare la potenza del laser per ciascun canale al 5-10%.
- Posizionare un vetrino sul microscopio.
- Scegli un cervello da fotografare usando l'attacco di epifluorescenza (vedi Tabella dei materiali).
- Nella modalità di acquisizione, selezionate 1024 x 1024 pixel come dimensione del fotogramma.
- Nella modalità di acquisizione, selezionare l'opzione Z-stack, indicare che Z-stack deve essere preso a sezioni di 2 μm e mettere a fuoco attraverso il campione, selezionando i piani focali superiore e inferiore da visualizzare.
- Raccogli immagini Z-stack di interi cervelli utilizzando un obiettivo 20x e regioni cerebrali specifiche come il corpo del fungo usando un obiettivo 60x.
6. Analisi dei dati
- Quantificare le cellule proliferanti e il numero di cloni perma-twin manualmente e/o utilizzando il software di analisi delle immagini (vedi Tabella dei materiali). Quando si utilizza il software, selezionare le regioni di interesse (ROI) con aree di almeno 10 μm.
Representative Results
PTBI stimola la proliferazione cellulare
Per determinare l'estensione della neurogenesi dopo un PTBI cerebrale centrale, la risposta proliferativa è stata misurata in giovani maschi adulti raccolti e feriti entro 6 ore dall'eclosione. Un aumento significativo della proliferazione è stato osservato 24 ore dopo l'infortunio utilizzando l'anti-fosfoistone 3 (PH3), un marker per le cellule attivamente sottoposte a mitosi. Circa 3 cellule PH3+ nel cervello centrale di controllo e 11 cellule PH3+ nel cervello centrale danneggiato sono osservate 24 ore dopo PTBI (Figura 2A-D). La maggior parte delle cellule in divisione si trova vicino al sito della lesione. Un secondo test per la divisione cellulare è stato utilizzato per quantificare la proliferazione cellulare cumulativa da una singola lesione e per valutare la misura in cui le cellule appena create sono sopravvissute. La 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) è un analogo della timidina che può essere incorporato nel DNA appena sintetizzato ed etichettare permanentemente le cellule che hanno subito la sintesi del DNA. Alle mosche è stato dato un impulso di 4 giorni di EdU, seguito da un inseguimento di 3 giorni. Ciò ha rivelato che le cellule marcate erano vitali e sopravvissute almeno 3 giorni dopo la proliferazione. Entro 7 giorni, c'erano una media di 2 cellule EdU + nel cervello centrale di controllo e una media di 11 cellule EdU + nei cervelli centrali danneggiati, rispettivamente (Figura 2E). Questo è simile ai risultati ottenuti 24 ore dopo l'infortunio utilizzando l'anticorpo PH3. Quando la proliferazione cellulare viene misurata a 14 giorni, i controlli non feriti hanno registrato una media di 1 cellula EdU + per cervello centrale, mentre i cervelli feriti hanno una media di 29 cellule EdU + (Figura 2E), dimostrando che la proliferazione cellulare continua almeno nella seconda settimana dopo un PTBI.
La proliferazione cellulare dipende dall'età
La maggiore risposta proliferativa nel cervello centrale è stata osservata entro le prime 24 ore dopo l'eclosione (Figura 3). Entro 7 giorni dopo l'eclosione, una lesione penetrante provoca ancora un aumento significativo della proliferazione, con una media di 6 cellule PH3 + per cervello centrale. Tuttavia, entro 14 giorni dopo l'eclosione, la capacità delle cellule di dividersi dopo PTBI diminuisce significativamente a 1 cellula in divisione, simile a quella dei cervelli di controllo (Figura 3). Pertanto, il potenziale di proliferazione cellulare post-PTBI dipende dall'età.
I neuroni appena creati possono proiettare per correggere le aree target
Per valutare la rigenerazione neurale post-PTBI, è stato utilizzato il sistema di etichettatura perma-twin15. Il lignaggio perma-gemello che traccia etichette in modo permanente le cellule che dividono e la loro progenie con una proteina fluorescente verde (GFP) o una proteina fluorescente rossa (RFP)15. Sono stati rilevati più cloni di perma-gemello nei campioni feriti, a 2 giorni e 2 settimane, che nei controlli (Figura 4A-E). In particolare, c'erano nuovi neuroni del corpo dei funghi in ~ 50% dei cervelli PTBI 2 settimane dopo l'infortunio (Figura 4N). Questi nuovi neuroni hanno proiettato i loro dendriti in modo appropriato al calice del corpo del fungo e ai loro assoni in modo appropriato ai lobi del corpo del fungo (Figura 4D, F, G). Ciò indica che le cellule appena create possono essere neuroni funzionali coinvolti nella riparazione dei corpi dei funghi danneggiati. Altre aree del cervello che sembravano rigenerarsi includono il corpo ellissoide (EB) (Figura 4H, I), i lobi antennali (AL) (Figura 4J, K) e il corno laterale (LH) (Figura 4L, M) che possedeva cloni di grandi dimensioni circa il 26%, il 26% e il 20% delle volte, rispettivamente (Figura 4N). Questi risultati sottolineano l'utilità di questo sistema per lo studio della neurogenesi adulta. Un modello proposto per la sequenza di eventi successivi al PTBI e che portano alla generazione di nuovi neuroni è mostrato nella Figura 5.
Figura 1: Lesione cerebrale traumatica penetrante (PTBI) al cervello centrale della Drosophila adulta . (A) Schema dell'esterno di una testa di mosca adulta. Questa è una vista frontale. Quindi, il lato destro dell'animale è alla sinistra dello spettatore. (B) Schema dell'interno di una testa di Drosophila adulta con la traiettoria della lesione indicata in grigio. Questa è una vista posteriore. Quindi, in questa immagine e nelle figure successive, il lato destro del cervello è a destra. Il PTBI cerebrale centrale influisce su più strutture cerebrali, tra cui il corpo dei funghi (verde) e i tessuti al di fuori del cervello, incluso il corpo grasso (blu) e gli emociti (rosso). CB = regione centrale del cervello. OL= regione del lobo ottico. (C) Vista dorsale di una testa adulta viva in cui i corpi dei funghi (punte di freccia) sono etichettati con una proteina fluorescente verde (GFP). Questo è il "genotipo standard" (vedi testo per i dettagli). Il protocollo PTBI provoca in modo riproducibile lesioni ai corpi dei funghi. Questa figura è stata adattata da Reference16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: PTBI stimola la proliferazione cellulare. Schemi di controllo non danneggiato (A) e PTBI (B). Le caselle blu negli angoli in alto a destra indicano le regioni del cervello mostrate a un ingrandimento più elevato nei pannelli (C) e (D). (C,D) L'anticorpo PH3 (rosso) è stato utilizzato per analizzare la proliferazione cellulare 24 ore dopo la lesione. Nel cervello di controllo (C), ci sono poche cellule PH3 + e nessuna vicino al MB. Tuttavia, nei cervelli PTBI (D), ci sono cellule PH3 + vicino al MB. (E) Quantificazione delle cellule proliferanti. I numeri riflettono le cellule proliferanti in tutto il cervello, non solo nelle vicinanze del corpo del fungo. A 24 ore, i cervelli di controllo non feriti avevano una media di 3 cellule PH3 + / cervello (n = 11 cervelli, 28 cellule), mentre 24 ore dopo PTBI, i cervelli avevano una media di 11 cellule PH3 + / cervello (n = 17 cervelli, 181 cellule). A 7 giorni, i controlli illesi hanno poche cellule EdU +, con una media di 2 cellule EdU + / cervello (n = 15 cervelli, 24 cellule), mentre i cervelli post-PTBI di 7 giorni avevano una media di 11 cellule EdU + / cervello (n = 22 cervelli, 238 cellule). A 14 giorni, i controlli illesi hanno una media di 1 cellula / cervello EdU + (n = 8 cervelli, 11 cellule), mentre i cervelli post-PTBI a 14 giorni hanno una media di 29 cellule EdU + / cervello (n = 14 cervelli, 400 cellule). Per questa serie di esperimenti, sono stati utilizzati giovani maschi adulti entro 6 ore dall'eclosione. I t-test non accoppiati di campioni di controllo e PTBI ai 3 punti temporali producono valori rispettivamente di p<0,0001, p<0,0001 e p<0,0002. Le barre di errore riflettono la deviazione standard (SD). Questa figura è stata adattata da Reference16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La risposta proliferativa al PTBI diminuisce con l'età. Per esplorare se l'età influisce sulla quantità di proliferazione cellulare che si verifica dopo la lesione, i maschi adulti appena echiusi sono stati confrontati con animali di età compresa tra 7 giorni, 14 giorni e 28 giorni prima del PTBI, utilizzando anti-PH3 per analizzare la proliferazione cellulare 24 ore dopo l'infortunio. Le mosche ferite entro 6 ore dall'eclosion avevano una media di 11 cellule PH3+ / cervello (n = 17 cervelli, 182 cellule) rispetto a una media di 3 cellule PH3 + / cervello nei controlli abbinati all'età (n = 11 cervelli, 28 cellule). Le mosche di età pari a 7 giorni, poi sottoposte a PTBI, avevano una media di 6 cellule PH3+ / cervello (n = 11 cervelli, 65 cellule) rispetto ai controlli abbinati all'età con una media di 2 cellule PH3 + / cervello (n = 5 cervelli, 12 cellule). Quando le mosche sono state invecchiate a 14 giorni prima del PTBI e analizzate 24 ore dopo, c'era una media di 1 cellula / cervello PH3 + (n = 8 cervelli, 11 cellule) simile ai controlli abbinati all'età, che aveva anche una media di 1 cellula / cervello PH3 + (n = 4 cervelli, 2 cellule). Il controllo illeso a 28 giorni (n = 4, 1 cellula) e ptbi (n = 3, 1 cellula) volano entrambi in media 0 PH3 + cellule / cervello. I t-test non accoppiati per PTBI per controllare i confronti in questi 4 punti temporali sono p<0.0001, p<0.04, p<0.07 e p<0.84, rispettivamente. Questa figura è stata adattata da Reference16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il tracciamento del lignaggio perma-gemello dimostra la rigenerazione cerebrale e il targeting appropriato degli assoni dopo PTBI. Il sistema di tracciamento del lignaggio perma-gemello15 è stato utilizzato per analizzare la neurogenesi dopo PTBI. Questo sistema etichetta in modo permanente le cellule che dividono e la progenie con una proteina fluorescente verde (GFP) o una proteina fluorescente rossa (RFP). Le mosche sono state allevate a 17 °C per mantenere il sistema spento durante lo sviluppo. I maschi F1 portatori di transgeni perma-gemelli sono stati raccolti al momento dell'eclosione, quindi feriti e posti a 30 ° C per recuperare per 2 o 14 giorni. (A) Nei controlli illesi di 2 giorni, ci sono alcune cellule GFP + sparse in tutto il cervello. (B) A 14 giorni, ci sono relativamente poche cellule GFP + presenti nel cervello centrale di controllo. (C) In confronto, i cervelli feriti di 2 giorni hanno più cellule GFP + che tendono a raggrupparsi vicino alla lesione (punta di freccia). (D) A 14 giorni dall'infortunio, ci sono cloni di grandi dimensioni vicino al sito della lesione. Alcuni di questi cloni hanno assoni che proiettano lungo i tratti del corpo del fungo (punta di freccia). Solo il canale GFP è mostrato qui; c'erano cloni RFP+ simili nei campioni PTBI. (E) Il numero di cloni aumenta nel tempo dopo ptbi.Il cervello non danneggiato di controllo (n = 13) ha una media di 10 cloni a 2 giorni, mentre i cervelli PTBI a 2 giorni (n = 20) hanno una media di 23 cloni (p<0,00002). A 7 giorni, i cervelli di controllo avevano una media di 9 cloni per cervello (n = 18), mentre i cervelli PTBI a 7 giorni avevano una media di 39 cloni per cervello (n = 16) (valore p<0,00000002). Questo è significativamente più del numero di cloni osservati a 2 giorni dopo l'infortunio (valore p<0,0009). Nei cervelli di controllo a 14 giorni, c'è una media di 10 cloni per cervello, che non è significativamente diversa dai controlli di 2 e 7 giorni. Tuttavia, a 14 giorni dopo il PTBI, c'è una media di 66 cloni GFP +, che è significativamente più dei controlli abbinati all'età (p <0,0000003) o dei cervelli post-PTBI di 2 giorni (valore p<0,0001). Le barre di errore riflettono SD. (F-M) PTBI stimola la formazione di cloni in più regioni del cervello. I pannelli sul lato sinistro sono schemi di regioni del cervello in cui sono stati trovati cloni di grandi dimensioni 14 giorni dopo ptbi (A, H, J, L). I pannelli a destra mostrano alti ingrandimenti di cervelli rappresentativi (G, I, K, M). Molti cervelli di 14 giorni avevano cloni che proiettavano in particolari aree target. Questi includevano il corpo del fungo (MB) (F, G), il corpo ellissoide (EB) (H, I), il lobo antennale (AL) (J, K) e il corno laterale (LH) (L, M). (N) Sia il numero di cloni che le dimensioni dei cloni aumentano con il tempo post-PTBI.Le proporzioni delle regioni cerebrali con cloni di grandi dimensioni sono state calcolate a 2, 7 e 14 giorni nei controlli e nei cervelli danneggiati. A 2 giorni, circa l'8% dei cervelli di controllo (n = 13) ha mostrato cloni di AL, mentre non c'erano cloni di AL nei cervelli feriti di 2 giorni (n = 20). Nei cervelli di controllo a 7 giorni (n = 18), il 6% aveva AL e il 6% aveva cloni di EB. A 7 giorni dopo ptbi (n = 16), il 6% dei cervelli aveva anche cloni di AL, il 6% aveva cloni di EB e il 19% aveva cloni di MB di grandi dimensioni. A 14 giorni, i cervelli di controllo (n = 9) non mostravano aree specifiche con cloni, mentre il 47% dei cervelli PTBI (n = 15) aveva cloni MB, il 20% dei cervelli PTBI aveva cloni AL e il 27% dei cervelli PTBI aveva cloni EB e il 27% aveva cloni LH. Questa figura è stata adattata da Reference16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Modello riassuntivo per la rigenerazione a seguito di lesioni cerebrali traumatiche penetranti (PTBI). Nella Drosophila giovane adulta, ci sono cellule quiescenti simili a neuroblasti all'interno del cervello centrale che mancano di espressione dei geni canonici dei neuroblasti. Entro 24 ore dopo il PTBI, le cellule quiescenti simili ai neuroblasti vengono attivate, esprimono i geni dei neuroblasti e hanno iniziato a proliferare. Sia a 4 h che a 24 h post-PTBI, c'è un'ondata di morte cellulare16. A 7 giorni, il tasso di proliferazione è ancora alto e molte delle nuove cellule hanno adottato identità cellulari mature, diventando neuroni o glia. A 14 giorni dopo il PTBI, grandi cloni di nuovi neuroni con assoni e dendriti si proiettano correttamente verso le rispettive aree target. Anche i difetti locomotori vengono ripristinati entro 14 giorni, suggerendo che la Drosophila adulta può rigenerarsi funzionalmente e strutturalmente. Questa figura è stata adattata da Reference16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Sebbene siano state descritte in precedenza lesioni penetranti al cervello di Drosophila adulta15,17,18, queste lesioni si sono concentrate sui lobi ottici e non sul cervello centrale. Inoltre, mancano istruzioni dettagliate su come eseguire le lesioni. Questo protocollo descrive un modello per la lesione penetrante al cervello centrale della Drosophila adulta che riproduce prove statisticamente significative per la neurogenesi adulta dopo PTBI.
La riproducibilità di questo protocollo PTBI è dovuta, in parte, al corpo del fungo come regione bersaglio della lesione. Il corpo del fungo è grande, costituito da ~ 2200 neuroni con dendrite complesso e pergole assoni in array grandi e altamente stereotipati18. I corpi cellulari dei neuroni del corpo dei funghi si trovano vicino alla superficie del cervello e possono essere visualizzati attraverso la cuticola della testa usando l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) (Figura 1C). I precursori del corpo dei funghi sono le ultime cellule staminali neurali a subire l'apoptosi durante lo sviluppo13,12,19. Pertanto, molti neuroni del corpo dei funghi sono piuttosto giovani al momento dell'eclosione. Ciò ha portato all'ipotesi che il corpo del fungo potrebbe avere più potenziale mitotico rispetto ad altre regioni del cervello16. Inoltre, il corpo del fungo è fondamentale per l'apprendimento e la memoria18. Ciò consente di chiedersi se la neurogenesi innescata da PTBI porti al recupero funzionale.
Altri fattori che contribuiscono alla riproducibilità dei risultati includono l'uso di mosche incrociate di genotipi coerenti, l'esecuzione di incroci nella stessa direzione ogni volta, il controllo preciso delle temperature di allevamento e invecchiamento e l'analisi separata di maschi e femmine. L'uso di mosche F1 da un outcross riduce la probabilità di analizzare il cervello omozigote per mutazioni spontanee. La croce standard di y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 femmine adulte a y[1] w[1] mosche maschio adulto risulta in F1 progenie del genotipo y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 è espresso in tutti i neuroni intrinseci del corpo del fungo e guida l'espressione del reporter legato alla membrana UAS-mCD8-GFP consentendo la visualizzazione dei corpi dei funghi e delle loro proiezioni. Per le croci perma-gemelle, le croci devono rimanere sempre a 17 °C per mantenere spento il sistema di tracciamento del lignaggio. Ciò garantisce che nessuna cellula in divisione sia etichettata durante lo sviluppo e che solo i neuroni e la glia nati in età adulta siano etichettati. A tal fine, la fly room può anche essere mantenuta a 17 °C. Sebbene la descrizione iniziale del sistema perma-twin15 raccomandasse l'allevamento delle mosche a 18 °C, ciò può portare a un'etichettatura di fondo significativa.
Per coerenza, si raccomanda inoltre di mantenere il controllo delle mosche illese sul pad co2 mentre si esegue il PTBI. Ciò garantisce che entrambi i gruppi di mosche abbiano un'esposizione anestetica identica. Inoltre, è auspicabile che la riproducibilità penetri completamente nella testa. Tuttavia, bisogna fare attenzione a non piegare la punta del perno contro il pad, rendendolo inutilizzabile per lesioni future. Per i professionisti qualificati, c'è poco danno involontario alle mosche PTBI. Tuttavia, premere troppo forte sul torace per stabilizzare la mosca durante l'infortunio può essere letale. Un modo per valutare l'entità della lesione non intenzionale è quantificare la mortalità delle mosche PTBI 24 ore dopo la lesione. Per le mosche ferite unilateralmente, questo può essere del 50% o superiore per i principianti. Pertanto, per garantire che i risultati osservati siano dovuti a PTBI e non a lesioni indesiderate, si consiglia ai principianti di praticare la somministrazione di PTBI su ~ 20 mosche al giorno per diverse settimane e non analizzare il cervello risultante fino a quando la mortalità di 24 ore è costantemente <10%.
Per quantificare la quantità di proliferazione stimolata dal PTBI cerebrale centrale, possono essere impiegati sia l'immunocolorazione anti-fosfoistone H3 (PH3) che l'incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU). Anti-PH3 etichetta le cellule prima e durante la metafase, limitando il rilevamento solo a una frazione delle cellule che si dividono attivamente. Pertanto, la colorazione anti-PH3 fornisce solo un assaggio parziale della proliferazione. EdU è un analogo della timidina che può essere incorporato nel DNA appena sintetizzato. Alimentando le mosche EdU prima e dopo l'infortunio, è possibile ottenere un quadro più completo delle cellule che si dividono o si sono divise dopo la lesione. Il fatto che tutte le cellule che si dividono siano marcate in modo permanente è utile sia per l'identificazione di cellule a ciclo lento che per testare la sopravvivenza delle cellule dopo la proliferazione iniziale. Per ragioni poco chiare, ma forse a causa della limitata permeabilità della barriera emato-encefalica, l'etichettatura EdU è inefficiente e sotto-segnala la proliferazione cellulare nel cervello adulto. Ciò è evidenziato dal numero simile di cellule PH3 + ed EdU + sia nel cervello di controllo che in quello sperimentale a 24 ore post-PTBI e osservando che solo un sottoinsieme di nuove cellule in cloni perma-gemelli incorpora EdU16. Per l'etichettatura massima, è essenziale pre-alimentare le mosche con EdU perché le mosche ferite non riprendono l'alimentazione per diverse ore dopo il PTBI. L'alimentazione è stata valutata aggiungendo colorante alimentare alla soluzione EdU e monitorando la quantità di colorante nell'intestino attraverso la cuticola addominale16.
Va notato che mentre abbiamo fornito un protocollo di dissezione cerebrale nella fase 4, possono essere utilizzate tecniche alternative. Molti di questi sono disponibili nei protocolli precedentemente pubblicati20,21,22. Drosophila melanogaster offre un modello a basso costo con potenti strumenti genetici e molecolari che possono essere utilizzati per studiare i meccanismi alla base della rigenerazione di più tessuti, tra cui l'intestino e i componenti del sistema nervoso. Un nuovo modello di lesione riproducibile che può essere utilizzato per studiare la risposta alle lesioni cerebrali è delineato qui. I dati ottenuti utilizzando questi protocolli supportano l'idea che il cervello centrale adulto di Drosophila mantenga la capacità proliferativa, generando nuovi neuroni in risposta alle lesioni. Queste osservazioni giustificano ulteriori indagini sia sull'estensione della neurogenesi adulta che sui suoi meccanismi molecolari sottostanti. Una volta identificati i componenti coinvolti nella rigenerazione neurale in questo sistema, possiamo convertire la nostra conoscenza della neurogenesi della Drosophila adulta negli esseri umani.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Siamo grati a Stacey Rimkus e Becky Katzenberger per l'assistenza tecnica e a Eduardo Moreno per aver condiviso le scorte perma-twin. Vorremmo ringraziare Barry Ganetzky e David Wassarman per le vivaci discussioni che indubbiamente hanno migliorato la scienza e Kent Mok, Cayla Guerra e Bailey Spiegelberg per i loro contributi al laboratorio. Gli anticorpi FasII sono stati sviluppati da Corey Goodman e ottenuti dalla Developmental Studies Hybridoma Bank, creata dal NICHD del NIH e mantenuta presso l'Università dell'Iowa, Dipartimento di Biologia, Iowa City, IA 52242. La maggior parte dei ceppi di Drosophila utilizzati in questo studio sono stati ottenuti dal Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; NIH P40OD018537). Questo lavoro è stato supportato da NIH T32 GM007133 (KLC); NIH NS090190 (GBF); NIH NS102698 (GBF); la University of Wisconsin Graduate School (GBF); e l'UW-Madison Women in Science and Engineering Leadership Institute (WISELI) (GBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
| 150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
| 18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
| 70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
| anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
| anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
| bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
| Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
| Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
| CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
| CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
| Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
| cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
| Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
| Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
| Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
| Microscope slides | any | for mounting brains | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
| mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
| NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
| P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
| phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
| rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
| Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
| Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
| Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |
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