In vitro Narkotika screening mot alle livssyklus stadier av Trypanosoma cruzi Bruke parasitter Uttrykke β-galactosidase
Summary
Vi beskriver en kolorimetrisk analyse med høy gjennomstrømning som måler β-galaktosidaseaktivitet i tre livssyklusstadier av Trypanosoma cruzi, det forårsakende middelet til Chagas sykdom. Denne analysen kan brukes til å identifisere trypanocidalforbindelser på en enkel, rask og reproduserbar måte.
Abstract
Trypanosoma cruzi er årsaksmidlet til Chagas sykdom (ChD), en endemisk sykdom av folkehelse betydning i Latin-Amerika som også påvirker mange ikke-endemiske land på grunn av økningen i migrasjon. Denne sykdommen rammer nesten 8 millioner mennesker, med nye tilfeller anslått til 50 000 per år. På 1960- og 70-tallet ble to legemidler for ChD-behandling introdusert: nifurtimox og benznidazol (BZN). Begge er effektive hos nyfødte og i den akutte fasen av sykdommen, men ikke i kronisk fase, og deres bruk er forbundet med viktige bivirkninger. Disse fakta understreker det presserende behovet for å intensivere søket etter nye stoffer mot T. cruzi.
T. cruzi overføres gjennom hematofagøse insektvektorer av familiene Reduviidae og Hemiptera. En gang i pattedyrverten multipliserer den intracellulært som den ikke-flagellerte amastigotformen og skiller seg ut i trypomastigoten, blodets ikke-replikative infeksjonsform. Inne i insektvektoren forvandles trypomastigoter til epimaskigotstadiet og formerer seg gjennom binær fisjon.
Dette papiret beskriver en analyse basert på måling av aktiviteten til cytoplasmatisk β-galaktosidase som slippes ut i kulturen på grunn av parasitter lysis ved bruk av substratet, klorfenolrødt β-D-galactopyranoside (CPRG). For dette ble T. cruzi Dm28c-stammen transfisert med en β-galaktosidase-overuttrykkende plasmid og brukt til in vitro farmakologisk screening i epimaskigot-, trypomastigot- og amastigotstadier. Dette papiret beskriver også hvordan man måler den enzymatiske aktiviteten i dyrkede epimastigoter, infiserte Vero-celler med amastigoter og trypomastigoter frigjort fra de dyrkede cellene ved hjelp av referansemedikamentet benznidazol, som et eksempel. Denne kolorimetriske analysen utføres enkelt og kan skaleres til et høyt gjennomstrømningsformat og påføres andre T. cruzi-stammer .
Introduction
Chagas sykdom (ChD), eller amerikansk trypanosomiasis, er en parasittisk sykdom forårsaket av flagellert protozo, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD begynner med en asymptomatisk eller oligosymptomatisk akutt fase som vanligvis er udiagnostisert, etterfulgt av en livslang kronisk fase. I kronisiteten manifesterer ~ 30% av pasientene – tiår etter infeksjonen – en rekke svekkende forhold, inkludert myokardiopati, mega-fordøyelsessyndromer, eller begge deler, med en dødelighet fra 0,2% til 20% 1,2,3. Asymptomatiske kroniske pasienter kan ikke ha noen kliniske tegn, men forblir seropositive gjennom hele livet.
Estimater tyder på at ~ 7 millioner mennesker er smittet over hele verden, hovedsakelig fra Latin-Amerika, hvor ChD er endemisk. I disse landene overføres T. cruzi hovedsakelig gjennom infiserte blodsugende triatominbugs (vektorbåren overføring) og sjeldnere ved oral overføring ved inntak av mat forurenset med triatomin avføring som inneholder parasittene2. I tillegg kan parasitten overføres via morkaken fra chagasiske mødre til nyfødte, gjennom blodtransfusjoner eller under organtransplantasjon. Disse vektoruavhengige måtene å skaffe seg infeksjonen og menneskelig migrasjon har bidratt til den verdensomspennende spredningen av sykdommen, dokumentert av et økende antall tilfeller i Nord-Amerika, Europa og noen afrikanske, østlige Middelhavet og vestlige Stillehavsland4. ChD regnes som en forsømt sykdom, da vektorbåren overføring er nært forbundet med fattigdom og er et ledende folkehelseproblem, spesielt i latinamerikanske lavinntektsland. Selv om det finnes tilgjengelige behandlinger, er dødeligheten på grunn av ChD i Latin-Amerika den høyeste blant parasittiske sykdommer, inkludert malaria2.
Det er to registrerte legemidler for ChD-behandling introdusert på slutten av 1960-tallet og begynnelsen av 1970-tallet: nifurtimox og benznidazol5. Begge legemidlene er effektive i den akutte fasen av sykdommen hos voksne, barn og medfødt infiserte nyfødte, så vel som hos barn med kronisk infeksjon, hvor kur vanligvis oppnås. Imidlertid blir bare noen få personer diagnostisert tidlig nok til å bli behandlet i tide. Ifølge de siste kliniske forsøkene har begge legemidlene viktige begrensninger hos voksne og var ineffektive for å redusere symptomer hos personer med kronisk sykdom; derfor er deres bruk i dette stadiet kontroversielt. Andre ulemper er de forlengede behandlingsperiodene som kreves (60-90 dager) og de hyppige, alvorlige bivirkningene som observeres, noe som fører til seponering av behandlingen hos en andel av smittede 6,7. Det anslås at færre enn 10% av personer med ChD har blitt diagnostisert, og enda færre har tilgang til behandling, da mange berørte individer bor i landlige områder med ingen eller knapp tilgang til helsetjenester8. Disse fakta fremhever det presserende behovet for å finne nye stoffer mot T. cruzi for å muliggjøre mer effektive, trygge og anvendelige behandlinger, spesielt for kronisk fase. I denne forbindelse er en annen utfordring i utviklingen av mer effektive forbindelser begrensningen av systemer for å vurdere legemiddeleffektivitet in vitro og in vivo9.
Selv om kjemisk biologi og genomiske tilnærminger for identifisering av potensielle legemiddelmål har blitt brukt i kinetoplastidparasitter, er de tilgjengelige genomiske verktøyene i T. cruzi begrenset i motsetning til T. brucei eller Leishmania. Dermed er screening av forbindelser med trypanocidal aktivitet fortsatt den mest brukte tilnærmingen i søket etter nye kjemoterapeutiske legemiddelkandidater mot ChD. Vanligvis må narkotikaoppdagelse i T. cruzi begynne med å teste effekten av et nytt stoff i en in vitro-analyse mot epimaskotstadiet. I flere tiår var den eneste måten å måle de hemmende effektene av kandidatforbindelser på T. cruzi manuell mikroskopisk telling, som er arbeidskrevende, tidkrevende og operatøravhengig. Videre er denne tilnærmingen egnet for å analysere et lite antall forbindelser, men er uakseptabelt for høy gjennomstrømningsscreening av store sammensatte biblioteker. I dag begynner mange undersøkelser med analysen av et stort antall forbindelser fra forskjellige opprinnelser som analyseres in vitro, og tester deres evne til å hemme parasittvekst. Både kolorimetriske og fluorometriske metoder er utviklet for å øke gjennomstrømningen i disse analysene, forbedre objektiviteten til screeningen og gjøre hele prosessen mindre kjedelig9.
En av de mest brukte kolorimetriske metodene er basert på den β-galaktosidaseaktiviteten til transfiserte parasitter først beskrevet av Bucknet og samarbeidspartnere10. Det β-galaktosidase-enzymet uttrykt av de rekombinante parasittene hydrolyserer det kromogene substratet, klorfenolrødt β-D-galactopyranoside (CPRG), til klorfenolrødt, som lett kan måles kolorimetrisk ved hjelp av et mikroplate-spektrofotometer. Dermed kan parasittvekst i nærvær av en rekke forbindelser samtidig evalueres og kvantifiseres i mikrotiterplater. Denne metoden har blitt brukt til å teste legemidler i epimaskigoteformer (tilstede i insektvektoren), trypomastigoter og intracellulære amastigoter, pattedyrstadiene av parasitten. Videre er flere rekombinante T. cruzi-stammer transfisert med pBS: CL-Neo-01 / BC-X-10 plasmid (pLacZ) 10 for å uttrykke Escherichia coli-β-galaktosidase-enzymet allerede tilgjengelige (og nye kan konstrueres), noe som gjør det mulig å evaluere parasitter fra forskjellige diskrete skriveenheter (DTU) som kanskje ikke oppfører seg likt mot de samme forbindelsene 10,11,12,13 . Denne metoden har allerede blitt brukt til å evaluere forbindelser for aktivitet mot T. cruzi i lav- og høy gjennomstrømningsscreening12,13. Lignende tilnærminger har også blitt brukt i andre protozoa parasitter, inkludert Toxoplasma gondii og Leishmania mexicana14,15.
Denne artikkelen beskriver og viser en detaljert metode for en in vitro medikamentell screening mot alle livssyklusstadier av T. cruzi ved bruk av parasitter som uttrykker β-galaktosidase. Analysene som presenteres her er utført med en β-galaktosidase-uttrykkende T. cruzi-linje oppnådd ved transfeksjon av T. cruzi Dm28c-stamme fra DTU I13 med pLacZ-plasmid (Dm28c/pLacZ). I tillegg kan den samme protokollen lett tilpasses andre stammer for å sammenligne ytelsen mellom forbindelser og mellom T. cruzi-stammer eller DTU-er.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papiret beskriver en analyse basert på å bestemme cytoplasmatiske β-galaktosidaseaktivitet utgitt på grunn av membranlyse av T. cruzi epimastigoter, trypomastigoter eller infiserte celler med amastigoter i nærvær av substratet CPRG. Vi brukte T. cruzi Dm28c/pLacZ parasitter, en stabil parasittstamme oppnådd etter transfeksjon med et β-galaktosidase-bærende plasmid konstruert av Buckner og medforfattere10. Denne analysen har blitt brukt til å søke etter antitrypan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Buckner for vennlig å gi pLacZ plasmid. Dette arbeidet ble støttet av Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva fra Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) og Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art ble brukt til å produsere figur 1 (https://smart.servier.com).
Materials
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
References
- Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
- Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
- Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
- Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
- Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
- Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
- Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
- Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
- Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
- Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
- Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
- García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
- Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
- Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
- Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
- Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
- Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).
