في المختبر فحص المخدرات ضد جميع مراحل دورة حياة المثقبيات الكروزية باستخدام الطفيليات التي تعبر عن β-galactosidase
Summary
نحن نصف مقايسة لونية عالية الإنتاجية تقيس نشاط β-galactosidase في ثلاث مراحل دورة حياة من Trypanosoma cruzi ، العامل المسبب لمرض شاغاس. يمكن استخدام هذا الفحص لتحديد مركبات المثقبيات بطريقة سهلة وسريعة وقابلة للتكرار.
Abstract
المثقبيات كروزي هي العامل المسبب لمرض شاغاس (ChD) ، وهو مرض متوطن له أهمية في مجال الصحة العامة في أمريكا اللاتينية ويؤثر أيضا على العديد من البلدان غير الموبوءة بسبب الزيادة في الهجرة. يصيب هذا المرض ما يقرب من 8 ملايين شخص ، مع حالات جديدة تقدر ب 50،000 حالة سنويا. في 1960s و 70s ، تم إدخال اثنين من الأدوية لعلاج ChD: nifurtimox و benznidazole (BZN). كلاهما فعال في الأطفال حديثي الولادة وخلال المرحلة الحادة من المرض ولكن ليس في المرحلة المزمنة ، ويرتبط استخدامهما بآثار جانبية مهمة. وتؤكد هذه الحقائق الحاجة الملحة إلى تكثيف البحث عن عقاقير جديدة ضد ت. كروزي.
ينتقل T. cruzi من خلال ناقلات الحشرات الدموية من عائلتي Reduviidae و Hemiptera. بمجرد وصوله إلى مضيف الثدييات ، فإنه يتكاثر داخل الخلايا كشكل amastigote غير السوط ويتمايز في trypomastigote ، وهو الشكل المعدي غير التكراري في مجرى الدم. داخل ناقل الحشرات ، تتحول المثقبيات إلى مرحلة epimastigote وتتكاثر من خلال الانشطار الثنائي.
تصف هذه الورقة مقايسة تعتمد على قياس نشاط السيتوبلازم β-galactosidase المنبعث في الثقافة بسبب تحلل الطفيليات باستخدام الركيزة ، الكلوروفينول الأحمر β-D-galactopyranoside (CPRG). لهذا ، تم نقل سلالة T. cruzi Dm28c مع بلازميد مفرط التعبير عن β-galactosidase واستخدامه في الفحص الدوائي في المختبر في مراحل epimastigote و trypomastigote و amastigote. تصف هذه الورقة أيضا كيفية قياس النشاط الأنزيمي في الظواهر المستزرعة ، وخلايا فيرو المصابة بالأماسيغوت ، والتريبومستيجوت المنبعثة من الخلايا المستزرعة باستخدام الدواء المرجعي ، البنزنيدازول ، كمثال. يتم إجراء هذا الفحص اللوني بسهولة ويمكن تحجيمه إلى تنسيق عالي الإنتاجية وتطبيقه على سلالات T. cruzi الأخرى.
Introduction
مرض شاغاس (ChD) ، أو داء المثقبيات الأمريكي ، هو مرض طفيلي تسببه البروتوزوان السوطية ، Trypanosoma cruzi (T. cruzi). يبدأ ChD بمرحلة حادة بدون أعراض أو قليلة الأعراض لا يتم تشخيصها عادة ، تليها مرحلة مزمنة مدى الحياة. في المزمنة ، ~ 30 ٪ من المرضى يظهرون بعد عقود من العدوى – مجموعة متنوعة من الحالات الموهنة ، بما في ذلك اعتلال عضلة القلب ، ومتلازمات الجهاز الهضمي الضخمة ، أو كليهما ، مع معدل وفيات يتراوح بين 0.2 ٪ إلى 20 ٪ 1،2،3. قد لا يكون لدى المرضى المزمنين الذين لا تظهر عليهم أعراض أي علامات سريرية ولكنهم يظلون إيجابيين مصليا طوال حياتهم.
تشير التقديرات إلى أن حوالي 7 ملايين شخص مصابون في جميع أنحاء العالم ، معظمهم من أمريكا اللاتينية ، حيث يتوطن ChD. وفي هذه البلدان، ينتقل T. cruzi أساسا عن طريق حشرات الترياتومين المصابة بالدم (الانتقال عن طريق النواقل) وأقل تواترا عن طريق الانتقال عن طريق الفم عن طريق تناول الأغذية الملوثة ببراز الترياتومين المحتوي على الطفيليات2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن ينتقل الطفيلي عبر المشيمة من الأمهات الشاغاسيات إلى الأطفال حديثي الولادة ، أو من خلال عمليات نقل الدم ، أو أثناء زراعة الأعضاء. وقد ساهمت هذه الطرق المستقلة عن النواقل للحصول على العدوى والهجرة البشرية في انتشار المرض في جميع أنحاء العالم، ويتضح ذلك من خلال عدد متزايد من الحالات في أمريكا الشمالية وأوروبا وبعض البلدان الأفريقية وشرق البحر الأبيض المتوسط وغرب المحيط الهادئ4. ويعتبر مرض الأمراض المزمنة مرضا مهملا لأن انتقال العدوى المنقولة بالنواقل يرتبط ارتباطا وثيقا بالفقر وهو قضية صحية عمومية رئيسية، ولا سيما في بلدان أمريكا اللاتينية المنخفضة الدخل. وعلى الرغم من توافر العلاجات، فإن معدل الوفيات الناجمة عن أمراض الكلى المزمنة في أمريكا اللاتينية هو الأعلى بين الأمراض الطفيلية، بما في ذلك الملاريا2.
هناك نوعان من الأدوية المسجلة لعلاج ChD أدخلت في أواخر 1960s وأوائل 1970s: nifurtimox و benznidazole5. كلا العقارين فعالان في المرحلة الحادة من المرض لدى البالغين والأطفال وحديثي الولادة المصابين خلقيا ، وكذلك في الأطفال المصابين بعدوى مزمنة ، حيث يتم تحقيق الشفاء عادة. ومع ذلك ، يتم تشخيص عدد قليل فقط من الأشخاص في وقت مبكر بما يكفي ليتم علاجهم في الوقت المناسب. وفقا لأحدث التجارب السريرية ، فإن كلا العقارين لهما قيود مهمة لدى البالغين ولم يكونا فعالين في تقليل الأعراض لدى الأشخاص الذين يعانون من أمراض مزمنة. وبالتالي ، فإن استخدامها في هذه المرحلة مثير للجدل. العيوب الأخرى هي فترات العلاج المطولة المطلوبة (60-90 يوما) والآثار الضارة المتكررة والشديدة التي لوحظت ، والتي تؤدي إلى التوقف عن العلاج في نسبة من المصابين 6,7. وتشير التقديرات إلى أن أقل من 10٪ من الأشخاص المصابين بأمراض القلب المزمنة قد تم تشخيصهم، بل إن عددا أقل منهم يمكنهم الحصول على العلاج، حيث يعيش العديد من الأفراد المتضررين في المناطق الريفية دون الحصولعلى الرعاية الصحية أو ندرة الوصول إليها8. تسلط هذه الحقائق الضوء على الحاجة الملحة لإيجاد أدوية جديدة ضد T. cruzi للسماح بعلاجات أكثر كفاءة وأمانا وقابلة للتطبيق في الميدان ، خاصة بالنسبة للمرحلة المزمنة. وفي هذا الصدد، هناك تحد آخر يواجه تطوير مركبات أكثر فعالية يتمثل في الحد من نظم تقييم فعالية الأدوية في المختبر وفي الجسم الحي9.
على الرغم من أن البيولوجيا الكيميائية والنهج الجينومية لتحديد أهداف الأدوية المحتملة قد استخدمت في طفيليات kinetoplastid ، فإن الأدوات الجينومية المتاحة في T. cruzi محدودة على النقيض من T. brucei أو Leishmania. وبالتالي ، فإن فحص المركبات ذات النشاط المبيد للمثقبيات لا يزال هو النهج الأكثر استخداما في البحث عن مرشحات جديدة للعلاج الكيميائي ضد ChD. عادة ، يجب أن يبدأ اكتشاف الدواء في T. cruzi باختبار آثار دواء جديد في فحص في المختبر ضد مرحلة epimastigote. لعقود من الزمان ، كانت الطريقة الوحيدة لقياس التأثيرات المثبطة للمركبات المرشحة على T. cruzi هي العد المجهري اليدوي ، وهو أمر شاق ومستهلك للوقت ويعتمد على المشغل. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج مناسب لفحص عدد صغير من المركبات ولكنه غير مقبول بالنسبة للفحص عالي الإنتاجية للمكتبات المركبة الكبيرة. في الوقت الحاضر ، تبدأ العديد من التحقيقات بتحليل عدد كبير من المركبات من أصول مختلفة يتم فحصها في المختبر ، واختبار قدرتها على تثبيط نمو الطفيليات. تم تطوير كل من طرق قياس الألوان والفلورومترات لزيادة الإنتاجية في هذه الفحوصات ، وتحسين موضوعية الفحص وجعل العملية برمتها أقل مملة9.
تعتمد إحدى طرق قياس الألوان الأكثر استخداما على نشاط β-galactosidase للطفيليات المنقولة التي وصفها Bucknet والمتعاونون معها لأول مرة10. يقوم إنزيم β-galactosidase الذي تعبر عنه الطفيليات المؤتلفة بتحلل الركيزة اللونية ، الكلوروفينول الأحمر β-D-galactopyranoside (CPRG) ، إلى الكلوروفينول الأحمر ، والذي يمكن قياسه بسهولة بالألوان باستخدام مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة. وبالتالي ، يمكن تقييم نمو الطفيليات في وجود مجموعة متنوعة من المركبات في وقت واحد وتحديدها كميا في لوحات microtiter. تم تطبيق هذه الطريقة لاختبار الأدوية في أشكال epimastigote (الموجودة في ناقل الحشرات) ، trypomastigotes ، و amastigotes داخل الخلايا ، المراحل الثديية للطفيلي. علاوة على ذلك ، تتوفر بالفعل العديد من سلالات T. cruzi المؤتلفة المنقولة باستخدام بلازميد pBS:CL-Neo-01 / BC-X-10 (pLacZ)10 للتعبير عن إنزيم الإشريكية القولونية β-galactosidase (ويمكن بناء أخرى جديدة) ، مما يسمح بتقييم الطفيليات من وحدات الكتابة المنفصلة المختلفة (DTUs) التي قد لا تتصرف بالتساوي تجاه نفس المركبات10,11,12,13 . وقد استخدمت هذه الطريقة بالفعل بنجاح لتقييم المركبات للنشاط ضد T. cruzi في فحص الإنتاجية المنخفضة والعالية12,13. كما تم استخدام نهج مماثلة في طفيليات أولية أخرى ، بما في ذلك التوكسوبلازما غوندي والليشمانيا المكسيكية14،15.
تصف هذه الورقة وتبين طريقة مفصلة لفحص المخدرات في المختبر ضد جميع مراحل دورة حياة T. cruzi باستخدام الطفيليات التي تعبر عن β-galactosidase. تم إجراء الفحوصات المعروضة هنا باستخدام خط T. cruzi المعبر عن β-galactosidase الذي تم الحصول عليه عن طريق نقل سلالة T. cruzi Dm28c من DTU I13 مع بلازميد pLacZ (Dm28c / pLacZ). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف نفس البروتوكول بسهولة مع السلالات الأخرى لمقارنة الأداء بين المركبات وبين سلالات T. cruzi أو DTUs.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الورقة فحصا يعتمد على تحديد نشاط β-galactosidase السيتوبلازمي الذي تم إطلاقه بسبب التحلل الغشائي ل T. cruzi epimastigotes أو trypomastigotes أو الخلايا المصابة ب amastigotes في وجود CPRG الركيزة. استخدمنا طفيليات T. cruzi Dm28c / pLacZ ، وهي سلالة طفيليات مستقرة تم الحصول عليها بعد النقل باستخدام بلازميد حامل β ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور باكنر على التكرم بتوفير بلازميد pLacZ. وقد تم دعم هذا العمل من قبل الوكالة الوطنية للترويج العلمي والتكنولوجي ووزارة العلوم والابتكار من الأرجنتين (PICT2016-0439، PICT2019-0526، PICT2019-4212)، ومجلس البحوث في المملكة المتحدة [MR/P027989/1]. تم استخدام فن سيرفييه الطبي لإنتاج الشكل 1 (https://smart.servier.com).
Materials
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
References
- Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
- Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
- Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
- Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
- Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
- Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
- Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
- Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
- Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
- Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
- Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
- García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
- Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
- Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
- Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
- Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
- Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).
