In vitro Läkemedelsscreening mot alla livscykelstadier av Trypanosoma cruzi med hjälp av parasiter som uttrycker β-galaktosidas
Summary
Vi beskriver en kolorimetrisk analys med hög genomströmning som mäter β-galaktosidasaktivitet i tre livscykelstadier av Trypanosoma cruzi, orsaksmedlet till Chagas sjukdom. Denna analys kan användas för att identifiera trypanocidala föreningar på ett enkelt, snabbt och reproducerbart sätt.
Abstract
Trypanosoma cruzi är orsaksmedlet för Chagas sjukdom (ChD), en endemisk sjukdom av folkhälsobetydelse i Latinamerika som också påverkar många icke-endemiska länder på grund av ökad migration. Denna sjukdom drabbar nästan 8 miljoner människor, med nya fall som uppskattas till 50 000 per år. På 1960- och 70-talet introducerades två läkemedel för ChD-behandling: nifurtimox och bensnidazol (BZN). Båda är effektiva hos nyfödda och under den akuta fasen av sjukdomen men inte i den kroniska fasen, och deras användning är förknippad med viktiga biverkningar. Dessa fakta understryker det brådskande behovet av att intensifiera sökandet efter nya droger mot T. cruzi.
T. cruzi överförs genom hematofagiska insektsvektorer av familjerna Reduviidae och Hemiptera. En gång i däggdjursvärden multipliceras den intracellulärt som den icke-flagellerade amastigotformen och differentieras till trypomastigoten, blodomloppets icke-replikativa infektionsform. Inuti insektsvektorn omvandlas trypomastigoter till epimastigotstadiet och multipliceras genom binär fission.
Denna uppsats beskriver en analys baserad på mätning av aktiviteten hos den cytoplasmatiska β-galaktosidas som släpps ut i kulturen på grund av parasiterlys genom att använda substratet, klorfenolrött β-D-galaktopyranosid (CPRG). För detta transinfekterades T. cruzi Dm28c-stammen med en β-galaktosidas-överuttryckande plasmid och användes för in vitro-farmakologisk screening i epimastigot-, trypomastigote- och amastigotstadier. Denna uppsats beskriver också hur man mäter den enzymatiska aktiviteten i odlade epimastigoter, infekterade Vero-celler med amastigotes och trypomastigotes som frigörs från de odlade cellerna med hjälp av referensläkemedlet bensnidazol som ett exempel. Denna kolorimetriska analys utförs enkelt och kan skalas till ett format med hög genomströmning och tillämpas på andra T. cruzi-stammar .
Introduction
Chagas sjukdom (ChD), eller amerikansk trypanosomiasis, är en parasitisk sjukdom som orsakas av den flagellerade protozoen, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD börjar med en asymptomatisk eller oligosymptomatisk akut fas som vanligtvis är odiagnostiserad, följt av en livslång kronisk fas. I kroniskhet manifesterar ~ 30% av patienterna årtionden efter infektionen – en mängd olika försvagande tillstånd, inklusive myokardiopati, mega-matsmältningssyndrom eller båda, med en dödlighet som sträcker sig från 0,2% till 20% 1,2,3. Asymptomatiska kroniska patienter kan inte ha några kliniska tecken men förblir seropositiva under hela livet.
Uppskattningar tyder på att ~ 7 miljoner människor är smittade över hela världen, mestadels från Latinamerika, där ChD är endemisk. I dessa länder överförs T. cruzi huvudsakligen genom infekterade blodsugande triatominbuggar (vektorburen överföring) och mindre ofta genom oral överföring genom intag av mat som är förorenad med triatomin avföring som innehåller parasiterna2. Dessutom kan parasiten överföras via moderkakan från chagasiska mödrar till nyfödda, genom blodtransfusioner eller under organtransplantation. Dessa vektoroberoende sätt att förvärva infektionen och mänsklig migration har bidragit till den globala spridningen av sjukdomen, vilket framgår av ett ökande antal fall i Nordamerika, Europa och vissa afrikanska, östra Medelhavet och västra Stilla havet4. ChD anses vara en försummad sjukdom eftersom vektorburen överföring är nära förknippad med fattigdom och är en ledande folkhälsofråga, särskilt i latinamerikanska låginkomstländer. Även om det finns tillgängliga behandlingar är dödligheten på grund av ChD i Latinamerika den högsta bland parasitsjukdomar, inklusive malaria2.
Det finns två registrerade läkemedel för ChD-behandling som introducerades i slutet av 1960-talet och början av 1970-talet: nifurtimox och bensnidazol5. Båda läkemedlen är effektiva i den akuta fasen av sjukdomen hos vuxna, barn och medfödda infekterade nyfödda, liksom hos barn med kronisk infektion, där botemedel vanligtvis uppnås. Men bara ett fåtal personer diagnostiseras tillräckligt tidigt för att behandlas i tid. Enligt de senaste kliniska prövningarna har båda läkemedlen viktiga begränsningar hos vuxna och var ineffektiva för att minska symtomen hos personer med kronisk sjukdom. därför är deras användning i detta skede kontroversiell. Andra nackdelar är de förlängda behandlingsperioder som krävs (60-90 dagar) och de frekventa, allvarliga biverkningar som observerats, vilket leder till att behandlingen avbryts hos en andel infekterade personer 6,7. Det uppskattas att färre än 10% av personerna med ChD har diagnostiserats, och ännu färre har tillgång till behandling, eftersom många drabbade individer bor på landsbygden med ingen eller knapp tillgång till vård8. Dessa fakta belyser det brådskande behovet av att hitta nya läkemedel mot T. cruzi för att möjliggöra mer effektiva, säkra och tillämpliga behandlingar på fältet, särskilt för den kroniska fasen. I detta avseende är en annan utmaning i utvecklingen av mer effektiva föreningar begränsningen av system för att bedöma läkemedelseffektivitet in vitro och in vivo9.
Även om kemisk biologi och genomiska metoder för identifiering av potentiella läkemedelsmål har använts i kinetoplastidparasiter, är de tillgängliga genomiska verktygen i T. cruzi begränsade i motsats till T. brucei eller Leishmania. Således är screening av föreningar med trypanocidal aktivitet fortfarande det mest använda tillvägagångssättet i sökandet efter nya kemoterapeutiska läkemedelskandidater mot ChD. Vanligtvis måste läkemedelsupptäckt i T. cruzi börja med att testa effekterna av ett nytt läkemedel i en in vitro-analys mot epimastigotstadiet. I årtionden var det enda sättet att mäta de hämmande effekterna av kandidatföreningar på T. cruzi manuell mikroskopisk räkning, vilket är mödosamt, tidskrävande och operatörsberoende. Dessutom är detta tillvägagångssätt lämpligt för analys av ett litet antal föreningar men är oacceptabelt för screening med hög genomströmning av stora sammansatta bibliotek. Numera börjar många undersökningar med analys av ett stort antal föreningar från olika ursprung som analyseras in vitro och testar deras förmåga att hämma parasittillväxt. Både kolorimetriska och fluorometriska metoder har utvecklats för att öka genomströmningen i dessa analyser, förbättra screeningens objektivitet och göra hela processen mindre tråkig9.
En av de mest använda kolorimetriska metoderna är baserad på β-galaktosidasaktiviteten hos transinfekterade parasiter som först beskrivits av Bucknet och medarbetare10. Enzymet β-galaktosidas uttryckt av de rekombinanta parasiterna hydrolyserar det kromogena substratet, klorfenolrött β-D-galaktopyranosid (CPRG), till klorfenolrött, som lätt kan mätas kolorimetriskt med hjälp av en mikroplattspektrofotometer. Således kan parasittillväxt i närvaro av en mängd olika föreningar samtidigt utvärderas och kvantifieras i mikrotiterplattor. Denna metod har tillämpats på testläkemedel i epimastigotformer (närvarande i insektsvektorn), trypomastigoter och intracellulära amastigoter, parasitens däggdjursstadier. Vidare finns det redan flera rekombinanta T. cruzi-stammar transfekterade med pBS:CL-Neo-01/BC-X-10-plasmiden (pLacZ)10 för att uttrycka enzymet Escherichia coli β-galaktosidas (och nya kan konstrueras), vilket möjliggör utvärdering av parasiter från olika diskreta skrivenheter (DTU) som kanske inte beter sig lika mot samma föreningar 10,11,12,13 . Denna metod har redan framgångsrikt använts för att utvärdera föreningar för aktivitet mot T. cruzi vid screening med låg och hög genomströmning12,13. Liknande metoder har också använts i andra protozoa parasiter, inklusive Toxoplasma gondii och Leishmania mexicana14,15.
Detta dokument beskriver och visar en detaljerad metod för en in vitro-läkemedelsscreening mot alla livscykelstadier av T. cruzi med hjälp av parasiter som uttrycker β-galaktosidas. Analyserna som presenteras här har utförts med en β-galaktosidasuttryckande T. cruzi-linje erhållen genom transfektion av T. cruzi Dm28c-stam från DTU I13 med pLacZ-plasmid (Dm28c / pLacZ). Dessutom kan samma protokoll enkelt anpassas till andra stammar för att jämföra prestandan mellan föreningar och mellan T. cruzi-stammar eller DTU.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta dokument beskriver en analys baserad på bestämning av cytoplasmatisk β-galaktosidasaktivitet som frigörs på grund av membranlys av T. cruzi-epimastigoter, trypomastigotes eller infekterade celler med amastigotes i närvaro av substratet CPRG. Vi använde T. cruzi Dm28c/pLacZ-parasiter, en stabil parasitstam som erhållits efter transfektion med en β-galaktosidasbärande plasmid konstruerad av Buckner och medförfattare10. Denna analys har använts för att söka efter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Buckner för att han vänligt tillhandahöll pLacZ-plasmiden. Detta arbete stöddes av Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva från Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) och Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art användes för att producera figur 1 (https://smart.servier.com).
Materials
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
References
- Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
- Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
- Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
- Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
- Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
- Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
- Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
- Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
- Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
- Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
- Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
- García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
- Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
- Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
- Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
- Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
- Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).
