Üç foton mikroskopisi, fare ve zebra balığı beyinleri gibi canlı biyolojik dokuların derinliklerinde, yüksek uzaysal zamansal çözünürlükte yüksek kontrastlı floresan görüntüleme sağlar.
İki foton mikroskobu (2PM) ve üç foton mikroskobu (3PM) gibi multifoton mikroskopi teknikleri, hücre altı çözünürlükte derin doku in vivo görüntüleme için güçlü araçlardır. 3PM, biyoloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan 2PM’ye göre derin doku görüntüleme için iki önemli avantaja sahiptir: (i) ~ 1.300 nm veya ~ 1.700 nm uyarma lazeri kullanılarak saçılma dokularında daha uzun zayıflama uzunluğu; (ii) daha yüksek dereceli doğrusal olmayan uyarma nedeniyle daha az arka plan floresan üretimi. Sonuç olarak, 3PM, kortikal katmanlardan hipokampusa ve yetişkin zebra balıklarının tüm ön beynine kadar bozulmamış fare beyni gibi saçılma dokularının derinliklerinde yüksek kontrastlı yapısal ve işlevsel görüntülemeye izin verir.
Bugün, 3PM için uygun lazer kaynakları ticari olarak temin edilebilmekte ve mevcut iki fotonlu (2P) görüntüleme sisteminin üç fotonlu (3P) bir sisteme dönüştürülmesini sağlamaktadır. Ek olarak, birden fazla ticari 3P mikroskop mevcuttur, bu da bu tekniği biyoloji araştırma laboratuvarları için hazır hale getirir. Bu makale, özellikle zaten 2P kurulumuna sahip biyoloji gruplarını hedefleyen tipik bir 3PM kurulumunun optimizasyonunu göstermektedir ve bozulmamış fare ve yetişkin zebra balığı beyinlerinde intravital 3D görüntülemeyi göstermektedir. Bu protokol, mikroskop hizalaması, ~ 1.300 ve ~ 1.700 nm lazer darbelerinin ön cıvıltıları, hayvan hazırlığı ve yetişkin zebra balığı ve fare beyinlerinin derinliklerinde intravital 3P floresan görüntüleme dahil olmak üzere 3P görüntülemenin tam deneysel prosedürünü kapsar.
Yaşam bilimlerinde, 2PM ve 3PM gibi çoklu foton mikroskopisi (MPM) teknikleri, yüksek uzaysal zamansal çözünürlük ve saçılma dokularında yüksek kontrast ile derin in vivo görüntüleme için güçlü araçlar olmuştur. Ek olarak, bu yöntemler tek fotonlu konfokal mikroskopi 1,2,3,4 ile karşılaştırıldığında daha az fotobeyazlatmaya neden olur. 3PM, iki ana özellik nedeniyle 2PM ile karşılaştırıldığında daha derin doku görüntülemesi için avantajlıdır: (i) daha uzun dalga boyu uyarımı (~1.300 nm veya ~1.700 nm) istihdamı doku saçılımını azaltır ve (ii) istenmeyen arka plan floresansını baskılayan daha yüksek dereceli uyarma işlemi (yani, floresan sinyali, 2PM’deki uyarma gücünün karesi yerine 3PM’deki uyarma gücünün küpüne bağlıdır) 3PM’de uyarılma gücüne bağlıdır3 . Sonuç olarak, 3PM, bozulmamış bir yetişkin fare beynindeki hipokampus 3,5,6,7,8,9,10,11 ve Ca2+ dahil olmak üzere yetişkin zebra balığı 12’nin tüm ön beyni gibi canlı dokuların daha derin bölgelerinde yüksek kontrastlı görüntüleme sağlar. aktivite kaydı ve çok renkli gözlemler. Ayrıca, fare ve yetişkin zebra balığı12,13’ün bozulmamış kafatasları aracılığıyla 3PM ile yüksek kontrastlı görüntüler elde edilmiştir.
Bugün, ~ 1.300 ve ~ 1.700 nm’de 3P uyarma (3PE) için uygun uyarma lazer kaynakları ticari olarak temin edilebilir. Lazer tarama sistemi esasen 2PM ve 3PM için aynı olduğundan, mevcut bir 2P kurulumunu 3P kurulumuna dönüştürmek, biyoloji laboratuvarlarında 3PE için ticari olarak temin edilebilen bir lazerin kurulmasıyla mümkündür. 3P floresan sinyali, objektif lensin lazer gücüne, darbe süresine, lazer tekrarlama hızına ve sayısal açıklığına (NA) bağlıdır. Kırınım sınırlı bir odağın (yani, objektif lensin arka açıklığının uyarma ışını tarafından aşırı doldurulduğunu) varsayarsak, Eq (1), 3PE’den kaynaklanan odak hacminden gelen zaman ortalamalı floresan foton akısını tanımlar.
(1)
Burada f, lazer tekrarlama hızıdır, τ lazer darbe süresidir (maksimum yarıda tam genişlik), φ sistem toplama verimliliğidir, η floresan kuantum verimliliğidir, σ3P absorpsiyon kesitidir, C florofor konsantrasyonudur, n0 numune ortamının yansıtıcı indeksidir (örneğin, su), λ vakumdaki uyarma dalga boyudur, NA, objektif lensin sayısal açıklığıdır, 3, odak hacminin uzamsal entegrasyon sabitidir, objektif lensin altındaki zaman ortalamalı uyarma foton akısıdır (fotonlar / s), z görüntülenen derinliktir ve EAL etkili zayıflama uzunluğu14’tür. Burada EAL’nin (tipik olarak 100 μm’>) mikroskopun eksenel çözünürlüğünden çok daha büyük olduğunu varsaydık (tipik olarak 10 μm'<). Paraksiyel yaklaşım altında,3 28.114’e eşittir. g p(3), uyarma kaynağının 3. dereceden zamansal tutarlılığıdır ve gp(3), hiperbolik-sekant-kareli darbeler ve gaussian darbeler için sırasıyla 0.41 ve 0.51’dir. φ toplama verimliliği, objektif lens tarafından floresan toplanması, objektif lensin geçirgenliği, dikroik aynanın yansıtıcılığı, filtrelerin geçirgenliği ve dedektörün algılama verimliliği (örneğin, fotoçarpan tüpü veya PMT) dikkate alınarak tahmin edilebilir. 3P floresan yoğunluğu çeşitli parametrelere büyük ölçüde bağlı olduğundan, 3P floresan sinyallerini en üst düzeye çıkarmak için 3P kurulumunun optimizasyonu gerekir.
Bu protokol, özellikle 2P kurulumuna sahip olan ve kapasitesini 3P görüntülemeye genişletmeyi veya ticari 3P kurulumlarını optimum performansta sürdürmeyi planlayan biyoloji laboratuvarları için yararlı olacak tipik bir 3P kurulumunun optimizasyon sürecini göstermektedir. Bu video makalesi aynı zamanda canlı hayvan beyinlerinde derin doku 3P görüntülemeyi de göstermektedir. İlk bölüm, ticari olarak temin edilebilen bir lazer kaynağı ve çoklu foton mikroskobu ile tipik bir 3P kurulumunun optimizasyonunu ele almaktadır. İkinci ve üçüncü bölümler, nöronal yapıların ve aktivitelerin 3PM için sırasıyla zebra balığı ve fare hazırlığını açıklar. Fare kraniyotomisi ameliyatı daha önce protokol belgelerinde de15,16,17 olarak bildirilmiştir. Dördüncü bölüm, zebra balığı ve fare beyinlerinde intravital 3P görüntülemeyi göstermektedir.
Bu protokol, ticari bir mikroskop ve lazer kaynağı ile 3P görüntüleme kurmak için adım adım prosedürleri açıklamaktadır. 2PM ile karşılaştırıldığında, 3PM, fare beyni hipokampüsü gibi daha derin bölgelerde optik erişim gerektiren uygulamalarda bir avantaja sahiptir. 3PM çoğunlukla sinirbilimde kullanılmasına rağmen, 3PM derin doku gözlemi için lenf düğümleri, kemikler ve tümörler gibi diğer dokularda potansiyel olarak uygulanabilir.
Görüntüleme sisteminin, algılama ve veri toplama elektroniklerinin PMT’lerden sonra görüntüye ihmal edilebilir bir parazit katkıda bulunmasını sağlayan çekim gürültüsü sınırına yakın bir hızda performans gösterdiğini doğrulamak önemlidir. Tespit edilen foton sayısındaki belirsizlik temelde foton atış gürültüsü ile sınırlıdır. Çekim gürültüsü sınırlı performansı, tipik bir çoklu foton mikroskobunda, yüksek kazançlı bir fotodetektör (örneğin, bir PMT) kullanılarak elde edilebilir. Foton atış gürültüsü, dağılımın standart sapmasının dağılım ortalamasının kareköküne eşit olduğu bir Poisson istatistiksel dağılımını izler. Çekim gürültüsü sınırlı performansını doğrulamak için, protokol bölümündeki 1.14 adımını izleyin.
H2 O ile hafif zayıflamayı önlemek için, daldırma için D2O kullanmak, özellikle ~ 1.700 nm uyarma için yararlıdır. D 2O kullanıldığında, görüntüleme sırasında D 2 O / H 2 O değişimini önlemek için her ~ 10 dakikada birD2O’nun yenilenmesi veyabüyük miktarda D2O kullanılması önemlidir. Ayrıca D2O’yu oda ortamından3. Görüntüleme için uzun çalışma mesafesi (WD) objektif lens (örneğin, 4 mm veya daha uzun WD) kullanılıyorsa, daldırma sıvısı kalınlığı 2-3 mm’yi aşabilir. Artan kalınlık,H2O absorpsiyonunu ~ 1.300 nm21’de bile ihmal edilemez hale getirir. Bu nedenle, uzun bir WD objektif lens kullanırken 1.300 nm 3PM için bile D2O gerekli olabilir.
3P floresan yoğunluğu, odaktaki uyarma darbe enerjisinin küpüne bağlı olduğundan (Eq. (1)), canlı dokularda termal ve doğrusal olmayan hasarı önlerken yeterli 3P floresan sinyallerini elde etmek için uygun lazer gücünün ayarlanması özellikle önemlidir. Ortalama lazer gücü termal hasar eşiğinin altında tutulmalıdır. Örneğin, fare beyninde, termal doku hasarını önlemek için, fare beyin yüzeyindeki ortalama güç, 1 mm derinlikte ~1.300 nm uyarma için ~100 mW’da veya altında tutulmalı ve 230 μm x 230 μm21’lik bir görüş alanı (FOV) ile tutulmalıdır. Benzer şekilde, ~ 1.700 nm’deki ortalama güç, ~ 1 mm derinlikte ~ 50 mW’da veya altında tutulmalı ve ~ 230 μm x 230 μm’lik bir FOV (yayınlanmamış veriler). Ayrıca, uyarma doygunluğunu ve potansiyel doğrusal olmayan hasarı önlemek için, uyarma darbe enerjisi sırasıyla ~ 1.300 nm ve ~ 1.700 nm uyarma için 2 nJ ve 3 nJ’de
tutulmalıdır.
Dokulardaki ışık emilimi ve saçılması nedeniyle, odaktaki nabız enerjisi, dokuların 1 EAL tarafından nüfuz edilmesinden sonra 1/e’ye (~% 37) kadar zayıflatılır. EAL farklı dokularda ve uyarma dalga boylarında, örneğin fare beyninin neokorteksinde değişir, EAL ~ 1.300 nm ve ~ 1.700 nm’de ~ 300 μm ve ~ 400 μm’dir, sırasıyla 3,29’dur (Şekil 5). Bu nedenle, aynı darbe enerjisini n EAL derinliğinde odakta (örneğin, 1 nJ / darbe) tutmak için, yüzey darbe enerjisinin 1 nJ × en ile çarpılması gerekir. Yapısal ve fonksiyonel dinamiklerin hızlı görüntülenmesi için, yüksek bir kare hızı 5,6,7,10 elde etmek için yüksek tekrarlama hızına (1 MHz veya daha yüksek) sahip bir uyarma lazeri arzu edilir. Bununla birlikte, darbe enerjisi gereksinimi ve ortalama lazer güç sınırı, uygulanabilir tekrarlama oranını kısıtlar.
Örneğin, 4 EAL’de orta derecede derin bir bölge görüntülediğimizde (yani, 1.300 nm uyarımla fare korteksinde ~ 1.2 mm), 1 nJ / darbeyi odakta tutmak için yüzeyde ~ 55 nJ / darbe gerekir. Ortalama güç sınırlaması 100 mW olduğunda, ~ 2 MHz lazer tekrarlama hızı uygulayabiliriz. Bununla birlikte, 7 EAL derinliğinde daha derin görüntü elde etmek için, odakta 1 nJ / darbeyi korumak için yüzeyde ~ 1.100 nJ / darbe gereklidir. Termal hasarı önlemek için maksimum ortalama gücün 100 mW olduğu varsayılarak, yüzeyde 1.100 nJ / darbe elde etmek için lazer tekrarlama hızı 0,1 MHz’ye düşürülmelidir. Tablo 1, fare beyin korteksindeki tipik görüntüleme koşullarını özetlemektedir. Tablo 1’deki görüntüleme derinliklerinin, EAL’nin tüm fare korteksinde eşit olduğunu varsaydığını unutmayın.
Dahası, derin doku 3PM’deki lazer güç sınırlaması nedeniyle, kare hızı ile görüntü piksel boyutu arasında bir denge vardır, bu da kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel görüntüleme için özellikle önemlidir. Mevcut maksimum lazer tekrarlama hızı, odaktaki gerekli darbe enerjisine ve yukarıda tartışıldığı gibi uygulanabilir ortalama lazer gücüne bağlı olarak her derinlikte kararlaştırılır, örneğin, 1.300 nm uyarma ile ~ 4 EAL’ye eşdeğer bir derinlikte 2 MHz. Genel olarak, görüntüleme piksel başına en az bir darbe gerektirir. Buna göre, mevcut minimum piksel bekleme süresi, lazer tekrarlama hızına göre belirlenir, örneğin, 2 MHz uyarma ile 0,5 μs / piksel.
3P görüntülerde yüksek uzamsal çözünürlüğü (yanal olarak ~1 μm) korumak için, 1 pikseli ~1 μm2’lik bir alana ayarlamak idealdir, örneğin, 250 x 250 μm2’lik bir FOV için 256 x 256 piksel. Bu nedenle, oldukça büyük bir FOV (örneğin, 256 x 256 piksel ile 250 x250 μm2), 0,5 MHz, 1 MHz ve 2 MHz darbe tekrarlama hızları ile hızlı görüntüleme gerçekleştirmek için sırasıyla ~ 7,6, ~ 15 ve ~ 30 kare / s teorik maksimum kare hızları verir. Benzer şekilde, termal hasar eşiğinin altında yeterli darbe enerjisi uygulamak için hedef derinliğe, tarama hızına ve FOV’a bağlı olarak lazer tekrarlama hızının optimizasyonu esastır. Görüntüleme hızını artırmak için, nöronlara talep üzerine lazer darbeleri göndererek tüm uyarma darbelerini nöronlara (yani ilgi alanlarına) yoğunlaştırmak için uyarlanabilir bir uyarma kaynağı kullanılabilir31.
3PM, canlı dokular içinde derin görüntülemede ve kafatası, kemikler ve fare beyninin beyaz madde tabakası (yani dış kapsül) gibi yüksek oranda saçılan ortamlar aracılığıyla 2PM ile karşılaştırıldığında avantajlıdır. 3PE’nin daha uzun EAL ve daha yüksek dereceli doğrusal olmayan uyarılması derin doku görüntülemeye fayda sağlar. Örneğin, fare korteksindeki GCaMP6’yı görüntülemek için, 920 nm uyarımlı 2P floresan sinyali, 690 μm’de sığ bölgelerde 1.300 nm uyarılma ile 3P floresan sinyalinden daha yüksektir (yani, 1.300 nm’de ~2.3 EAL)21. Bununla birlikte, 920 nm’ye kıyasla 1.300 nm’de daha uzun EAL nedeniyle, 3PE, ~ 690 μm derinlikte ve daha derin21’de 2P uyarımdan (2PE) daha güçlü floresan verir. Bu derinlik, 2PE ve 3PE’lik floresan sinyal kuvvetlerinin aynı tekrarlama oranı ve aynı izin verilen maksimum ortalama güçler21 ile aynı olduğu ‘sinyal çapraz derinliği’ olarak tanımlanır. Sinyal çapraz derinliği, 2PE ve 3PE için uyarma dalga boylarına ve florofora bağlıdır.
Uygulamada, 920 nm uyarım, daha az su emilimi nedeniyle 1.300 nm uyarmadan daha yüksek ortalama lazer gücüne izin verir. Bununla birlikte, 2PE’nin daha yüksek ortalama gücü, sinyal çapraz derinliğini yalnızca 0,9 EAL4 ile itecektir. Ek olarak, numune yoğun bir şekilde etiketlendiğinde, 3PE çok daha yüksek SBR’nin ek avantajına sahiptir. Bu nedenle, sinyal çapraz uzunluğuna ulaşmadan önce bile, 3PM, görüntüleme için 2PM’den daha iyi olabilir. Örneğin, ~% 2’lik bir hacim fraksiyonuna (yani etiketleme yoğunluğuna) sahip fare beyin vaskülatürünü görüntülerken, 100 mW uyarma gücüne sahip 1.300 nm 3PM, floresein için ~ 700 μm derinlikte 200 mW uyarma gücü ile 920 nm 2PM’den daha iyi performans gösterir.
3PM ayrıca, uyarma ışınının nokta yayılma işlevini bozabilecek ve bulanıklaştırma arka planıoluşturabilecek ince ama yüksek oranda saçılan bir tabakadan görüntüleme yaparken de bir avantaja sahiptir 4. Örneğin, fare beyninin bozulmamış kafatası boyunca, 2PM görüntüleri, beyin yüzeyinden13 μm <100 μm'lik sığ derinlikte bile bulanıklaştırma arka planından muzdariptir. Benzer bir bulanıklaştırma arka planı, fare beynindeki beyaz madde32 aracılığıyla 1.280 nm uyarılma ile 2PM’de gözlendi. Bu nedenle, dokular bulanık tabakalar yoluyla görüntülendiğinde, etiketleme yoğunluğundan bağımsız olarak yüksek kontrastlı görüntüleme için 3PM’den 2PM’ye tercih edilir.
Son zamanlarda, 3PM’nin görüntüleme derinliği sınırının 8 EAL 33’ün üzerinde olduğunu gösteren bir boncukhayaleti ve teorik analiz bildirdik; 8 EAL, fare korteksinde ~ 1.700 nm uyarma ile ~ 3 mm’ye eşdeğerdir. Bununla birlikte, şu anda mevcut olan lazer, fare beyninde 8 EAL elde etmek için yeterli darbe enerjisine sahip değildir. Daha güçlü lazerlerin daha da geliştirilmesi, mevcut görüntüleme derinliği sınırını 3PM’ye zorlayacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub ve NIH 1U01NS103516 tarafından desteklenmiştir.
5% Povidone-iodine | Amazon | NDC 67818-155-32 | Aceptical cleaning of surgical areas |
70% Ethanol | Thermo Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | Aceptical cleaning of surgical areas |
Agarose | Sigma | A4718-256 | Preparing zebrafish chamber |
Atropine | Cornell Veterinary Care | ||
Bergamo II | Thorlabs | Multiphoton Imaging Microscope | |
Bupivacaine | Cornell Veterinary Care | ||
Dexamethasone | Cornell Veterinary Care | ||
Donut shape glass (ID4.5, OD6.5) | Potomac Photonics | Cover glass used for craniotomy | |
eye ointment (or topical ophthalmic ointment) | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia |
GaAsP Amplified PMT | Thorlabs | PMT2100 | PMT detector |
Glucose | Cornell Veterinary Care | ||
Glycopyrrolate | Cornell Veterinary Care | ||
Heater (800 W) | Finnex | Aquarium heater for zebrafish water) | |
Isoflurane USP 250 mL | Piramal | NDC 66794-0013-25 | For anesthesia of mice |
Ketoprofen | Cornell Veterinary Care | ||
Kimwipes | Kimtech | Laboratory tissue for preparing zebrafish | |
Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle | WPI | NANOFIL + NF36BV | Syringe and needle for injection of pancuronium bromide |
Optical Adhesive | Norland | NOA 68 | To stick round coverslip and donut shape glass together. |
Pancuronium Bromide | Cornell Veterinary Care | ||
Peristaltic Pump | Elemental Science | ESI MP2 | Water pump for zebrafish setup |
Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.) | Elemental Science | MP2 pump tubing | Tubing that goes in the mouth of the zebrafish |
Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm | Electron Microscopy Sciences | 7229605 | Cover glass used for craniotomy |
Spirit-NOPA | Spectra Physics | Tunable Optical Parametric Amplifier | |
SR400 | Stanford Research Systems | SR400 | Photon counter |
Standard Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S122C | Power detector |
Sterilized phosphate buffered saline (PBS) | Millipore Sigma | SKU 806552-500ml | Used during mouse brain surgery |
Surgical drape | Dynarex disposable towel drape | 4410 | For aceptical mouse surgery |
Thin strip boxing wax | Corning Rubber Co., Inc. | Holding tubing in place in zebrafish chamber | |
ThorImage | Thorlabs | Image acquisition software | |
Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt) | MP | 103106 | Zebrafish anesthesia and euthanasia |
Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.) | Tygon | Tubing for water flow for zebrafish preparation | |
VaporGuard | VetEquip | 931401 | For recycling isoflurane |
Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish. |
XLPLN25XWMP2 | Olympus | Multiphoton Excitation Dedicated Objective |