बैक्टीरियल गतिशीलता में बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए नल उत्परिवर्ती की पीढ़ी
Summary
यहां, हम विशिष्ट ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ या ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ वाले क्षेत्रों में एयरोमोनास के शून्य उत्परिवर्ती के निर्माण का वर्णन करते हैं, गतिशीलता assays, और फ्लैगेला शुद्धिकरण एक ग्लाइकन के जैवसंश्लेषण में उनके एन्कोडेड एंजाइमों की भागीदारी और कार्य को स्थापित करने के लिए किया जाता है, साथ ही साथ जीवाणु रोगजनन में इस ग्लाइकन की भूमिका भी।
Abstract
प्रोकैरियोट्स में ग्लाइकोसिलेशन का अध्ययन एक तेजी से बढ़ता हुआ क्षेत्र है। बैक्टीरिया अपनी सतह पर विभिन्न ग्लाइकोसिलेटेड संरचनाओं को आश्रय देते हैं जिनके ग्लाइकन एक तनाव-विशिष्ट बारकोड का गठन करते हैं। संबद्ध ग्लाइकन यूकेरियोट्स की तुलना में चीनी संरचना और संरचना में उच्च विविधता दिखाते हैं और बैक्टीरिया-मेजबान मान्यता प्रक्रियाओं और पर्यावरण के साथ बातचीत में महत्वपूर्ण हैं। रोगजनक बैक्टीरिया में, ग्लाइकोप्रोटीन संक्रामक प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में शामिल किए गए हैं, और ग्लाइकन संशोधन ग्लाइकोप्रोटीन के विशिष्ट कार्यों में हस्तक्षेप कर सकते हैं। हालांकि, ग्लाइकन संरचना, संरचना और जैवसंश्लेषण मार्गों की समझ में की गई प्रगति के बावजूद, रोगजनकता या पर्यावरण के साथ बातचीत में ग्लाइकोप्रोटीन की भूमिका की समझ बहुत सीमित है। इसके अलावा, कुछ बैक्टीरिया में, प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन के लिए आवश्यक एंजाइमों को अन्य पॉलीसेकेराइड बायोसिंथेटिक मार्गों के साथ साझा किया जाता है, जैसे कि लिपोपॉलीसेकेराइड और कैप्सूल बायोसिंथेटिक मार्ग। ग्लाइकोसिलेशन के कार्यात्मक महत्व को ग्लाइकोसिलेशन प्रक्रिया में शामिल होने के लिए माना जाने वाले विशिष्ट जीनों के उत्परिवर्तन के माध्यम से कई बैक्टीरिया में स्पष्ट किया गया है और लक्ष्य ग्लाइकोप्रोटीन की अभिव्यक्ति और संशोधित ग्लाइकन पर इसके प्रभाव का अध्ययन किया गया है। मेसोफिलिक एयरोमोनास में एक एकल और ओ-ग्लाइकोसिलेटेड ध्रुवीय फ्लैगेलम होता है। फ्लैगेलर ग्लाइकन एरोमोनास उपभेदों के बीच कार्बोहाइड्रेट संरचना और श्रृंखला की लंबाई में विविधता दिखाते हैं। हालांकि, आज तक विश्लेषण किए गए सभी उपभेदों में एक pseudaminic एसिड व्युत्पन्न को जोड़ने वाली चीनी के रूप में दिखाया गया है जो सेरीन या थ्रेओनिन अवशेषों को संशोधित करता है। ध्रुवीय फ्लैगेला असेंबली के लिए pseudaminic एसिड व्युत्पन्न की आवश्यकता होती है, और इसके नुकसान का आसंजन, बायोफिल्म गठन और उपनिवेशीकरण पर प्रभाव पड़ता है। इस लेख में विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है कि कैसे नल उत्परिवर्ती के निर्माण का उपयोग जीन या जीनोम क्षेत्रों की भागीदारी को समझने के लिए किया जा सकता है जिसमें फ्लैगेलर ग्लाइकन के जैवसंश्लेषण में कल्पित ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ होते हैं। इसमें शामिल ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ के कार्य और ग्लाइकन की भूमिका को समझने की क्षमता शामिल है। यह ग्लाइकन की कमी वाले उत्परिवर्ती की तुलना जंगली प्रकार के तनाव से करके प्राप्त किया जाएगा।
Introduction
प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन को ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया दोनों में वर्णित किया गया है और इसमें एक अमीनो एसिड साइड चेन 1,2 के लिए ग्लाइकन के सहसंयोजक लगाव शामिल हैं। प्रोकैरियोट्स में, यह प्रक्रिया आमतौर पर दो प्रमुख एंजाइमेटिक तंत्रों के माध्यम से होती है: ओ- और एन-ग्लाइकोसिलेशन 3। ओ-ग्लाइकोसिलेशन में, ग्लाइकन एक सेरीन (सेर) या थ्रेओनिन (थ्र) अवशेषों के हाइड्रॉक्सिल समूह से जुड़ा होता है। एन-ग्लाइकोसिलेशन में, ग्लाइकन को ट्रिपेप्टाइड अनुक्रमों के भीतर एक शतावरी (एएसएन) अवशेषों के साइड चेन एमाइड नाइट्रोजन से जोड़ा जाता है Asn-X-Ser / Thr, जहां एक्स प्रोलाइन को छोड़कर कोई भी अमीनो एसिड हो सकता है।
ग्लाइकन रैखिक या शाखित संरचनाओं को अपना सकते हैं और मोनोसेकेराइड या पॉलीसेकेराइड से बने होते हैं जो ग्लाइकोसिडिक बांड द्वारा सहसंयोजक रूप से जुड़े होते हैं। प्रोकैरियोट्स में, ग्लाइकन आमतौर पर यूकेरियोटिक ग्लाइकन4 की तुलना में चीनी संरचना और संरचना में विविधता दिखाते हैं। इसके अलावा, दो अलग-अलग बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन मार्ग जो इस बात से भिन्न होते हैं कि ग्लाइकन को कैसे इकट्ठा किया जाता है और स्वीकर्ता प्रोटीन में स्थानांतरित किया जाता है, का वर्णन किया गया है: अनुक्रमिक और एन ब्लॉक ग्लाइकोसिलेशन 5,6। अनुक्रमिक ग्लाइकोसिलेशन के लिए, जटिल ग्लाइकन को मोनोसेकेराइड के क्रमिक जोड़ द्वारा प्रोटीन पर सीधे बनाया जाता है। एन ब्लॉक ग्लाइकोसिलेशन में, एक पूर्व-इकट्ठे ग्लाइकन को लिपिड-लिंक्ड ओलिगोसेकेराइड से प्रोटीन में एक विशेष ओलिगोसेकरिलट्रांसफरेज़ (ओटास) द्वारा स्थानांतरित किया जाता है। दोनों मार्गों को एन- और ओ-ग्लाइकोसिलेशन प्रक्रियाओं 7 में शामिल होने के लिए दिखाया गयाहै।
प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन की प्रोटीन के भौतिक-रासायनिक और जैविक गुणों को संशोधित करने में एक भूमिका है। ग्लाइकन की उपस्थिति प्रभावित कर सकती है कि प्रोटीन अपने लिगैंड के साथ कैसे बातचीत करता है, जो प्रोटीन की जैविक गतिविधि को प्रभावित करता है, लेकिन प्रोटीन स्थिरता, घुलनशीलता, प्रोटियोलिसिस, इम्युनोजेनेसिटी और माइक्रोब-होस्ट इंटरैक्शन के प्रति संवेदनशीलता को भी प्रभावित कर सकताहै। हालांकि, कई ग्लाइकोसिलेशन पैरामीटर, जैसे ग्लाइकन की संख्या, ग्लाइकन संरचना, स्थिति और अनुलग्नक तंत्र, प्रोटीन फ़ंक्शन और संरचना को भी प्रभावित कर सकते हैं।
ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ (जीटी) जटिल ग्लाइकन और ग्लाइकोकॉन्जुगेट्स के जैवसंश्लेषण में प्रमुख एंजाइम हैं। ये एंजाइम एक सक्रिय दाता अणु और एक विशिष्ट सब्सट्रेट स्वीकर्ता से एक चीनी समूह के बीच ग्लाइकोसिडिक बॉन्ड गठन को उत्प्रेरित करते हैं। जीटी न्यूक्लियोटाइड्स और गैर-न्यूक्लियोटाइड्स दोनों को दाता अणुओं के रूप में उपयोग कर सकते हैं और विभिन्न सब्सट्रेट स्वीकर्ताओं को लक्षित कर सकते हैं, जैसे कि प्रोटीन, सैकेराइड, न्यूक्लिक एसिड और लिपिड10। इसलिए, आणविक स्तर पर जीटी को समझना कार्रवाई और विशिष्टता के उनके तंत्र की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है, और यह भी समझने में सक्षम बनाता है कि प्रासंगिक अणुओं को संशोधित करने वाले ग्लाइकन की चीनी संरचना रोगजनकता से कैसे संबंधित है। कार्बोहाइड्रेट सक्रिय एंजाइम डेटाबेस (CAZy) 11 अपने अनुक्रम होमोलॉजी के अनुसार जीटी को वर्गीकृत करता है, जो एक भविष्यवाणी उपकरण प्रदान करता है क्योंकि, अधिकांश जीटी परिवारों में, संरचनात्मक गुना और कार्रवाई के तंत्र अपरिवर्तनीय हैं। हालांकि, चार कारणों से कई जीटी की सब्सट्रेट विशिष्टता की भविष्यवाणी करना मुश्किल हो जाता है: 1) प्रोकैरियोट्स में सब्सट्रेट विशिष्टता का निर्धारण करने वाला कोई स्पष्ट अनुक्रम आकृति निर्धारित नहीं किया गया है12, 2) कई जीटी और ओटी सब्सट्रेट संकीर्णता दिखाते हैं13,14, 3) कार्यात्मक जीटी पुनः संयोजक रूप में उच्च उपज में उत्पादन करना मुश्किल है और 4) दाता और स्वीकर्ता सब्सट्रेट दोनों की पहचान जटिल है। इसके बावजूद, हाल के म्यूटाजेनेसिस अध्ययनों ने उत्प्रेरक तंत्र की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति प्राप्त करना और जीटी के बंधन को घटाना संभव बना दिया है।
बैक्टीरिया में, ओ-ग्लाइकोसिलेशन एन-ग्लाइकोसिलेशन की तुलना में अधिक प्रचलित प्रतीत होता है। ओ-ग्लाइकोसिलेशन साइटें एक आम सहमति अनुक्रम नहीं दिखाती हैं, और कई ओ-ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन स्रावित या सेल-सतह प्रोटीन होते हैं, जैसे कि फ्लैगेलिन, पिली, या ऑटोट्रांसपोर्टर 1। फ्लैगेलिन ग्लाइकोसिलेशन स्वीकर्ता साइटों, ग्लाइकन संरचना और संरचना की संख्या में परिवर्तनशीलता दिखाता है। उदाहरण के लिए, Burkholderia spp flagellins में केवल एक स्वीकर्ता साइट है, जबकि कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी में, फ्लैगेलिन में 19 स्वीकर्ता साइटें15,16 हैं। इसके अलावा, कुछ बैक्टीरिया के लिए, ग्लाइकन एक एकल मोनोसेकेराइड है, जबकि अन्य बैक्टीरिया में ओलिगोसेकेराइड बनाने के लिए विभिन्न मोनोसेकेराइड्स से समझौता करने वाले विषम ग्लाइकन होते हैं। यह विषमता एक ही प्रजाति के उपभेदों के बीच भी होती है। हेलिकोबैक्टर फ्लैगेलिन को केवल pseudaminic acid (PseAc)17 द्वारा संशोधित किया जाता है, और Campylobacter flagellins को PseAc द्वारा संशोधित किया जा सकता है, pseudaminic acid (PseAm) या legionaminic acid (LegAm) का एसिटामिडिनो रूप, और एसिटाइल, एन-एसिटाइलग्लूकोसामाइन, या प्रोपियोनिक प्रतिस्थापन 18,19 के साथ इन शर्करा से व्युत्पन्न ग्लाइकन। एयरोमोनास में, फ्लैगेलिन को ग्लाइकन द्वारा संशोधित किया जाता है, जिनकी संरचना एक एकल पीएसईएसी एसिड व्युत्पन्न से लेकर हेटेरोपॉलीसेकेराइड20 तक होती है, और फ्लैगेलिन मोनोमर्स के लिए ग्लाइकन का लगाव हमेशा पीएसईएसी व्युत्पन्न के माध्यम से होता है।
सामान्य तौर पर, फ्लैगेलिन का ग्लाइकोसिलेशन फ्लैगेलर फिलामेंट असेंबली, गतिशीलता, वायरस और मेजबान विशिष्टता के लिए आवश्यक है। हालांकि, जबकि सी जेजुनी16, एच पाइलोरी17, और एरोमोनास एसपी के फ्लैगेलिन। 21 फिलामेंट में इकट्ठा नहीं हो सकता है जब तक कि प्रोटीन मोनोमर्स ग्लाइकोसिलेटेड, स्यूडोमोनास एसपीपी और बर्कहोल्डेरिया एसपीपी न हों। 15 फ्लैगेला असेंबली के लिए ग्लाइकोसिलेशन की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, कुछ सी जेजुनी उपभेदों में, फ्लैगेला ग्लाइकन की चीनी संरचना में परिवर्तन बैक्टीरिया-मेजबान बातचीत को प्रभावित करते हैं और कुछ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने में भूमिका निभा सकते हैं। Autoagglutination एक और फेनोटाइपिक विशेषता है जो फ्लैगेलिन से जुड़े ग्लाइकन की संरचना में संशोधनों से प्रभावित होती है। एक कम autoagglutination microcolonies और biofilm22 बनाने की क्षमता में कमी की ओर जाता है। कुछ बैक्टीरिया में, एक समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए फ्लैगेला की क्षमता फ्लैगेलिन ग्लाइकोसिलेशन से जुड़ी हुई थी। इस प्रकार, पी एरुगिनोसा में, ग्लाइकोसिलेटेड फ्लैगेलिन अनग्लाइकोसिलेटेड23 की तुलना में एक उच्च समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है।
एयरोमोनास पर्यावरण में सर्वव्यापी ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया हैं, जो उन्हें सभी एक स्वास्थ्य घटकों के इंटरफ़ेस पर होने की अनुमति देता है। मेसोफिलिक एयरोमोनास में एक एकल ध्रुवीय फ्लैगेलम होता है, जो संरचनात्मक रूप से उत्पादित होता है। नैदानिक आइसोलेट्स के आधे से अधिक भी पार्श्व फ्लैगेलिन व्यक्त करते हैं, जो उच्च चिपचिपाहट मीडिया या प्लेटों में कम करने योग्य है। विभिन्न अध्ययनों ने बैक्टीरियल रोगजनन 25 के शुरुआती चरणों के साथ दोनों फ्लैगेला प्रकारों से संबंधितकिया है। जबकि आज तक रिपोर्ट किए गए ध्रुवीय फ्लैगेलिन ओ-ग्लाइकोसिलेटेड होते हैं, जो इसके केंद्रीय इम्युनोजेनिक डोमेन के 5-8 सेर या थ्र अवशेषों पर होते हैं, पार्श्व फ्लैगेलिन सभी उपभेदों में ओ-ग्लाइकोसिलेटेड नहीं होते हैं। यद्यपि विभिन्न उपभेदों से ध्रुवीय फ्लैगेला ग्लाइकन अपने कार्बोहाइड्रेट संरचना और श्रृंखला की लंबाई20 में विविधता दिखाते हैं, चीनी को जोड़ने के लिए एक pseudaminic एसिड व्युत्पन्न होने के लिए दिखाया गया है।
इस पांडुलिपि का लक्ष्य विशिष्ट जीटी या क्रोमोसोमल क्षेत्रों में शून्य उत्परिवर्ती प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करना है जिसमें जीटी शामिल हैं ताकि प्रासंगिक पॉलीसेकेराइड के जैवसंश्लेषण में और जीवाणु रोगजनकता में उनकी भागीदारी का विश्लेषण किया जा सके, साथ ही ग्लाइकन की भूमिका भी। एक उदाहरण के रूप में, हम ध्रुवीय फ्लैगेलिन ग्लाइकोसिलेशन में अपनी भागीदारी स्थापित करने और फ्लैगेलिन ग्लाइकन की भूमिका का विश्लेषण करने के लिए एयरोमोनास के जीटी वाले क्रोमोसोमल क्षेत्र की पहचान करते हैं और हटाते हैं। हम दिखाते हैं कि इस ग्लाइकन के जैवसंश्लेषण और संशोधित ग्लाइकन की भूमिका में अपने कार्य को स्थापित करने के लिए एक विशिष्ट जीटी को कैसे हटाया जाए। हालांकि एक उदाहरण के रूप में एरोमोनास का उपयोग करते हुए, सिद्धांत का उपयोग अन्य ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के फ्लैगेला ग्लाइकोसिलेशन द्वीपों की पहचान और अध्ययन करने और ओ-एंटीजन लिपोपॉलीसेकेराइड जैसे अन्य ग्लाइकन के जैवसंश्लेषण में शामिल जीटी के कार्य का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि का महत्वपूर्ण प्रारंभिक चरण फ्लैगेला और कल्पित जीटी के ग्लाइकोसिलेशन में शामिल क्षेत्रों की पहचान है क्योंकि ये एंजाइम उच्च होमोलॉजी दिखाते हैं और कई प्रक्रियाओं में शामिल होते हैं। सार्वज?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद कनाडा द्वारा समर्थित किया गया था, योजना Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, स्पेन) के लिए और Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia) के लिए।
Materials
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
Referências
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