产生空突变体以阐明细菌糖基转移酶在细菌运动中的作用
Summary
在这里，我们描述了在特定的糖基转移酶或含有糖基转移酶的区域中 构建气单胞菌 的零突变体，进行运动性测定和鞭毛纯化以确定其编码酶在聚糖生物合成中的参与和功能，以及该聚糖在细菌发病机制中的作用。
Abstract
原核生物糖基化的研究是一个快速增长的领域。细菌在其表面上具有不同的糖基化结构，其聚糖构成菌株特异性条形码。与真核生物相比，相关的聚糖在糖组成和结构上表现出更高的多样性，并且在细菌 – 宿主识别过程和与环境的相互作用中很重要。在致病细菌中，糖蛋白已参与感染过程的不同阶段，聚糖修饰会干扰糖蛋白的特定功能。然而，尽管在理解聚糖组成，结构和生物合成途径方面取得了进展，但对糖蛋白在致病性或与环境相互作用中的作用的理解仍然非常有限。此外，在一些细菌中，蛋白质糖基化所需的酶与其他多糖生物合成途径共享，例如脂多糖和胶囊生物合成途径。糖基化的功能重要性已在几种细菌中阐明，通过突变被认为参与糖基化过程的特定基因，并研究其对目标糖蛋白和修饰聚糖表达的影响。嗜温 性气单胞菌 具有单一和 O-糖基化的极性鞭毛。鞭毛聚糖在 气单胞菌 菌株之间显示出碳水化合物成分和链长的多样性。然而，迄今为止分析的所有菌株都显示假氨基酸衍生物作为修饰丝氨酸或苏氨酸残基的连接糖。假鞭毛组装需要假单胞菌酸衍生物，其损失对粘附、生物膜形成和定植有影响。本文中详述的方案描述了如何使用零突变体的构建来了解含有假定糖基转移酶的基因或基因组区域在鞭毛聚糖的生物合成中的参与。这包括了解所涉及的糖基转移酶的功能和聚糖的作用的潜力。这将通过将缺乏聚糖的突变体与野生型菌株进行比较来实现。
Introduction
蛋白质糖基化已在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中均有描述，并且由聚糖与氨基酸侧链1，2的共价连接组成。在原核生物中，该过程通常 通过 两种主要的酶机制发生： O- 和 N-糖基化3。在 O-糖基化中，聚糖连接到丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基的羟基上。在 N-糖基化中，聚糖附着在三肽序列Asn-X-Ser/Thr中的天冬酰胺（Asn）残基的侧链酰胺氮上，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。
聚糖可以采用线性或支链结构，由糖苷键共价连接的单糖或多糖组成。在原核生物中，与真核聚糖4相比，聚糖通常显示出糖组成和结构的多样性。此外，已经描述了两种不同的细菌糖基化途径，它们在聚糖如何组装和转移到受体蛋白方面有所不同：序贯和 整体 糖基化5，6。对于顺序糖基化，复合聚糖通过连续添加单糖直接在蛋白质上建立。在 整体 糖基化中，预组装的聚糖通过专门的寡糖转移酶（OTase）从脂质连接的低聚糖转移到蛋白质中。这两种途径已被证明参与 N- 和 O-糖基化过程7。
蛋白质糖基化在调节蛋白质的物理化学和生物学特性方面具有作用。聚糖的存在可以影响蛋白质与其配体的相互作用，从而影响蛋白质的生物活性，但也可以影响蛋白质的稳定性，溶解度，对蛋白水解的易感性，免疫原性和微生物 – 宿主相互作用8，9。然而，一些糖基化参数，如聚糖的数量，聚糖组成，位置和附着机制，也可能影响蛋白质的功能和结构。
糖基转移酶（GTs）是复合聚糖和糖偶联物生物合成的关键酶。这些酶催化来自活化的供体分子和特定底物受体的糖部分之间的糖苷键形成。GT可以使用核苷酸和非核苷酸作为供体分子，并靶向不同的底物受体，例如蛋白质，糖类，核酸和脂质10。因此，在分子水平上了解GT对于确定其作用机制和特异性非常重要，并且还可以了解修饰相关分子的聚糖的糖组成如何与致病性相关。碳水化合物活性酶数据库（CAZy）11 根据其序列同源性对GT进行分类，这提供了一种预测工具，因为在大多数GT家族中，结构折叠和作用机制是不变的。然而，四个原因使得难以预测许多GT的底物特异性：1）在原核生物中没有确定底物特异性的明确序列基序12，2）许多GT和OT酶显示底物混杂性13，14，3）功能性GT难以以重组形式高产地产生;4）供体和受体底物的鉴定很复杂。尽管如此，最近的诱变研究使得在理解催化机制和减去GT结合方面取得了重大进展。
在细菌中，O-糖基化似乎比 N-糖基化更普遍。 O-糖基化位点不显示一致序列，许多 O-糖基化蛋白是分泌的或细胞表面蛋白，如鞭毛，毛利或自转运蛋白1。鞭毛蛋白糖基化显示受体位点数量、聚糖组成和结构的变异性。例如， Burkholderia spp鞭毛虫只有一个受体位点，而在 空肠弯曲杆菌中，鞭毛林具有多达19个受体位点15，16个。此外，对于某些细菌，聚糖是单一单糖，而其他细菌具有由不同单糖破坏形成寡糖的异质聚糖。这种异质性甚至发生在同一物种的菌株中。鞭毛虫杆菌 仅由假氨基酸（PseAc）17修饰，鞭毛 弯曲杆菌 可以通过PseAc（假氨基酸（PseAm）或军团胺酸（LegAm）的乙酰脒形式）和从这些糖中提取的聚糖与乙酰基， N-乙酰葡糖胺或丙酸取代物18，19进行修饰。在 气单胞菌中，鞭毛被聚糖修饰，其组成范围从单个PseAc酸衍生物到杂多糖20，并且聚糖与鞭毛蛋白单体的连接总是 通过 PseAc衍生物。
一般来说，鞭毛的糖基化对于鞭毛细丝组装、运动性、毒力和宿主特异性至关重要。然而，虽然C. jejuni16，H. pylori17和Aeromonas sp的鞭毛。21不能组装成长丝，除非蛋白质单体被糖基化，假单胞菌属和伯克霍尔德菌属。15 不需要糖基化来组装鞭毛。此外，在一些空肠衣原体菌株中，鞭毛聚糖的糖组成的变化会影响细菌 – 宿主的相互作用，并可能在逃避某些免疫反应中发挥作用16。自凝集是另一种表型特征，受与鞭毛林相关的聚糖组成的修饰的影响。较低的自凝集导致形成微菌落和生物膜22的能力降低。在一些细菌中，鞭毛触发促炎反应的能力与鞭毛蛋白糖基化有关。因此，在铜绿假单胞菌中，糖基化的鞭毛蛋白诱导比未烷基化23更高的促炎反应。
气单胞菌是环境中无处不在的革兰氏阴性细菌，这使得它们能够位于所有One Health组件24的界面处。嗜中性气单胞菌具有单一的极性鞭毛，其构成性地产生。超过一半的临床分离物也表达侧鞭毛蛋白，在高粘度介质或平板中诱导。不同的研究将两种鞭毛类型与细菌发病机制的早期阶段联系起来25。虽然迄今为止报道的极性鞭毛在5-8 Ser或Thr残基的中枢免疫原性结构域处呈O-糖基化，但侧鞭毛林在所有菌株中均未O-糖基化。尽管来自不同菌株的极性鞭毛聚糖在其碳水化合物组成和链长20上显示出多样性，但连接糖已被证明是一种假单胺酸衍生物。
本手稿的目的是描述一种在含有GT的特定GT或染色体区域获得零突变体的方法，以分析它们在相关多糖的生物合成和细菌致病性中的参与，以及聚糖本身的作用。例如，我们鉴定并删除了含有 气单胞菌 GT的染色体区域，以确定其参与极性鞭毛蛋白糖基化并分析鞭毛蛋白聚糖的作用。我们展示了如何删除特定的GT以建立其在该聚糖的生物合成中的功能和修饰聚糖的作用。虽然以 气单胞菌 为例，但该原理可用于鉴定和研究其他革兰氏阴性菌的鞭毛糖基化岛，并分析参与其他聚糖（如O-抗原脂多糖）生物合成的GT的功能。
Protocol
Representative Results
Discussion
该方法的关键早期步骤是鉴定参与鞭毛和推定GT糖基化的区域，因为这些酶显示出高度同源性并参与许多过程。公共数据库中 气单胞菌 基因组的生物信息学分析表明，该区域与极鞭毛区域2相邻，该区域包含许多菌株中的鞭毛蛋白基因，并含有参与拟南芥酸生物合成的基因27。这使得有可能制定检测 气单胞菌 中鞭毛糖基化岛的指南，该指南可用于识别鞭毛聚糖含有?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了加拿大国家研究委员会、西班牙国家经济和竞争部计划和加泰罗尼亚政府的支持。
Materials
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
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