Evaluación de la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra adultos
Summary
Capaz de recuperarse funcionalmente después de una lesión de la médula espinal, el pez cebra adulto es un sistema modelo de primer nivel para dilucidar los mecanismos innatos de regeneración neuronal. Aquí, describimos la resistencia a la natación y los ensayos de comportamiento de natación como lecturas funcionales de la regeneración de la médula espinal.
Abstract
Debido a su reconocida capacidad regenerativa, el pez cebra adulto es un modelo de vertebrado de primer nivel para interrogar los mecanismos de regeneración innata de la médula espinal. Después de la transección completa de su médula espinal, el pez cebra extiende los puentes gliales y axonales a través del tejido cortado, regenera las neuronas proximales a la lesión y recupera sus capacidades de natación dentro de las 8 semanas posteriores a la lesión. La recuperación de la función de natación es, por lo tanto, una lectura central para la reparación funcional de la médula espinal. Aquí, describimos un conjunto de ensayos de comportamiento para cuantificar la capacidad motora del pez cebra dentro de un túnel de natación cerrado. El objetivo de estos métodos es proporcionar mediciones cuantificables de la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra adultos. Para la resistencia a la natación, el pez cebra está sujeto a una velocidad de corriente de agua en constante aumento hasta el agotamiento, y se informa el tiempo de agotamiento. Para la evaluación del comportamiento de natación, los peces cebra se someten a bajas velocidades de corriente y los videos de natación se capturan con una vista dorsal de los peces. El porcentaje de actividad, la frecuencia de ráfaga y el tiempo pasado contra la corriente de agua proporcionan lecturas cuantificables del comportamiento de la natación. Cuantificamos la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra de tipo salvaje antes de la lesión y después de la transección de la médula espinal. Encontramos que el pez cebra pierde la función de natación después de la transección de la médula espinal y recupera gradualmente esa capacidad entre 2 y 6 semanas después de la lesión. Los métodos descritos en este estudio podrían aplicarse a estudios neuroconductuales, musculoesqueléticos, de regeneración muscular esquelética y de regeneración neuronal en peces cebra adultos.
Introduction
El pez cebra adulto se utiliza eminentemente para investigar mecanismos de desarrollo neuromuscular y musculoesquelético y modelado de enfermedades1,2,3. El pez cebra es capaz de reparar de manera eficiente y espontánea múltiples tejidos, incluidos el cerebro, la médula espinal y el músculo esquelético4,5,6,7. La notable capacidad para regenerar tejidos neuromusculares y enfermedades modelo está atrayendo a una creciente comunidad científica a la investigación del pez cebra adulto1,2,3. Sin embargo, si bien los ensayos de locomoción y comportamiento de natación están disponibles y estandarizados para el pez cebra larval, existe una creciente necesidad de desarrollar protocolos análogos en peces adultos8,9,10,11. El objetivo de este estudio es describir protocolos para cuantificar la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra adultos. Presentamos estos protocolos en el contexto de la investigación de la regeneración de la médula espinal. Sin embargo, los protocolos conductuales descritos aquí son igualmente aplicables a los estudios de regeneración neuronal y muscular, desarrollo neuromuscular y musculoesquelético, así como al modelado de enfermedades neuromusculares y musculoesqueléticas.
El pez cebra revierte la parálisis dentro de las 8 semanas posteriores a la transección completa de la médula espinal. A diferencia de los mamíferos poco regenerativos, el pez cebra muestra respuestas pro-regenerativas de lesiones inmunes, neuronales y gliales que se requieren para la reparación funcional de la médula espinal12,13,14. Una lectura definitiva de la reparación funcional de la médula espinal es la capacidad del tejido lesionado para recuperar su función después de la lesión. Un conjunto de métodos estandarizados para evaluar la regeneración funcional en roedores incluye pruebas locomotoras, motoras, sensoriales y sensoriomotoras15,16,17. Las pruebas ampliamente utilizadas en la lesión de la médula espinal de ratón de ratón incluyen la escala locomotora Basso Mouse (BMS), las pruebas motoras de extremidades anteriores, las pruebas sensoriales táctiles y las pruebas sensoriomotoras de marcha en rejilla15,17. En contraste con los sistemas de peces cebra de mamíferos o larvas, las pruebas de comportamiento en peces cebra adultos están menos desarrolladas, pero son muy necesarias para adaptarse a las crecientes necesidades de las comunidades de regeneración de tejidos y modelado de enfermedades.
Las transecciones completas de la médula espinal resultan en parálisis caudal completa al sitio de la lesión. Poco después de la lesión, los animales paralizados son menos activos y evitan nadar tanto como sea posible. Para compensar la pérdida de capacidad de natación, los animales paralizados muestran ráfagas cortas y frecuentes al abusar de sus aletas pectorales, que se encuentran rostrales de la lesión. Esta estrategia de natación compensatoria da como resultado un agotamiento rápido y una menor capacidad de natación. A medida que la médula espinal del pez cebra se regenera, los animales recuperan una función de natación oscilatoria suave caudal a la lesión, lo que permite una mayor resistencia a la natación y mejores parámetros de comportamiento de natación. Aquí, describimos métodos para cuantificar la resistencia a nadar del pez cebra a velocidades de corriente de agua crecientes y el comportamiento de natación a bajas velocidades de corriente.
Protocol
Representative Results
Discussion
El pez cebra adulto es un sistema popular de vertebrados para modelar enfermedades humanas y estudiar mecanismos de regeneración de tejidos. La edición del genoma CRISPR/Cas9 ha revolucionado los estudios genéticos inversos para modelar enfermedades en peces cebra; sin embargo, la genética a gran escala en peces cebra adultos se ha visto obstaculizada por desafíos biológicos y técnicos, incluida la falta de disponibilidad de tejidos adultos de pez cebra para fenotipos de alto rendimiento. Dada la compleja anatomí…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Recurso Compartido de Pez Cebra de la Universidad de Washington por el cuidado de los animales. Esta investigación fue apoyada por el NIH (R01 NS113915 a M.H.M.).
Materials
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter – for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe – for calibration |
Referências
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