Évaluation de l’endurance à la nage et du comportement de nage chez le poisson-zèbre adulte

Summary

Capable de récupération fonctionnelle après une lésion de la moelle épinière, le poisson-zèbre adulte est un système modèle de premier plan pour élucider les mécanismes innés de la régénération neuronale. Ici, nous décrivons les tests d’endurance et de comportement de natation comme des lectures fonctionnelles de la régénération de la moelle épinière.

Abstract

En raison de leur capacité de régénération reconnue, les poissons-zèbres adultes sont un modèle de premier plan pour les vertébrés pour interroger les mécanismes de régénération innée de la moelle épinière. Après une transsection complète de leur moelle épinière, les poissons-zèbres étendent les ponts gliaux et axonaux à travers les tissus sectionnés, régénèrent les neurones proximaux de la lésion et retrouvent leurs capacités de nage dans les 8 semaines suivant la blessure. La récupération de la fonction de nage est donc une lecture centrale pour la réparation fonctionnelle de la moelle épinière. Ici, nous décrivons un ensemble de tests comportementaux pour quantifier la capacité motrice du poisson-zèbre à l’intérieur d’un tunnel de nage fermé. L’objectif de ces méthodes est de fournir des mesures quantifiables de l’endurance à la nage et du comportement de nage chez les poissons-zèbres adultes. Pour l’endurance de la natation, les poissons-zèbres sont soumis à une vitesse de courant d’eau en constante augmentation jusqu’à épuisement et le temps d’épuisement est signalé. Pour l’évaluation du comportement de nage, les poissons-zèbres sont soumis à de faibles vitesses de courant et les vidéos de natation sont capturées avec une vue dorsale du poisson. Le pourcentage d’activité, la fréquence des rafales et le temps passé contre le courant de l’eau fournissent des lectures quantifiables du comportement de nage. Nous avons quantifié l’endurance à la nage et le comportement de nage chez les poissons-zèbres de type sauvage avant les blessures et après la transsection de la moelle épinière. Nous avons constaté que le poisson-zèbre perdait sa fonction de nage après la transsection de la moelle épinière et retrouvait progressivement cette capacité entre 2 et 6 semaines après la blessure. Les méthodes décrites dans cette étude pourraient être appliquées aux études neurocomportementales, musculo-squelettiques, de régénération musculaire squelettique et de régénération neuronale chez le poisson-zèbre adulte.

Introduction

Les poissons-zèbres adultes sont éminemment utilisés pour étudier les mécanismes du développement neuromusculaire et musculo-squelettique et la modélisation des maladies1,2,3. Les poissons-zèbres sont capables de réparer efficacement et spontanément plusieurs tissus, y compris le cerveau, la moelle épinière et les muscles ^{squelettiques4,5,6,7}. La capacité remarquable de régénérer les tissus neuromusculaires et de modéliser les maladies attire une communauté scientifique croissante dans la recherche sur le poisson-zèbre ^adulte1,2,3. Cependant, bien que des tests de locomotion et de comportement de nage soient disponibles et normalisés pour les larves de poisson-zèbre, il est de plus en plus nécessaire de développer des protocoles analogues chez les poissons adultes8,9,10,11. L’objectif de cette étude est de décrire des protocoles pour quantifier l’endurance à la nage et le comportement de nage chez le poisson-zèbre adulte. Nous présentons ces protocoles dans le contexte de la recherche sur la régénération de la moelle épinière. Cependant, les protocoles comportementaux décrits ici sont également applicables aux études sur la régénération neuronale et musculaire, le développement neuromusculaire et musculo-squelettique, ainsi que la modélisation des maladies neuromusculaires et musculo-squelettiques.

Paralysie inverse du poisson-zèbre dans les 8 semaines suivant la transsection complète de la moelle épinière. Contrairement aux mammifères peu régénératifs, les poissons-zèbres présentent des réponses pro-régénératives immunitaires, neuronales et gliales nécessaires à la réparation fonctionnelle de la moelle épinière12,13,14. Une lecture ultime de la réparation fonctionnelle de la moelle épinière est la capacité du tissu lésionné à retrouver sa fonction après une blessure. Une série de méthodes normalisées pour évaluer la régénération fonctionnelle chez les rongeurs comprend des tests locomoteurs, moteurs, sensoriels et sensorimoteurs15,16,17. Les tests largement utilisés dans les lésions de la moelle épinière chez la souris comprennent l’échelle locomotrice basso mouse Scale (BMS), les tests moteurs des membres antérieurs, les tests sensoriels tactiles et les tests sensorimoteurs de marche en ^grille15,17. Contrairement aux systèmes de poissons-zèbres mammifères ou larvaires, les tests comportementaux chez les poissons-zèbres adultes sont moins développés, mais beaucoup plus nécessaires pour répondre aux besoins croissants des communautés de régénération tissulaire et de modélisation des maladies.

Les transsections complètes de la moelle épinière entraînent une paralysie complète caudale au site de la blessure. Peu de temps après la blessure, les animaux paralysés sont moins actifs et évitent autant que possible de nager. Pour compenser la perte de capacité de nage, les animaux paralysés présentent des éclats courts et fréquents en surutilisant leurs nageoires pectorales, qui sont rostrales à la lésion. Cette stratégie de nage compensatoire entraîne un épuisement rapide et une capacité de nage inférieure. Au fur et à mesure que la moelle épinière du poisson-zèbre se régénère, les animaux retrouvent une fonction de nage oscillatoire lisse caudale à la lésion, ce qui permet une endurance accrue à la nage et des paramètres de comportement de nage améliorés. Ici, nous décrivons des méthodes pour quantifier l’endurance de nage du poisson-zèbre à des vitesses de courant d’eau croissantes et le comportement de nage à de faibles vitesses de courant.

Protocol

Les poissons-zèbres adultes des souches Ekkwill et AB ont été maintenus à l’installation centrale Zebrafish de l’Université de Washington. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles institutionnels de l’IACUC sur les animaux. REMARQUE : Un exemple de configuration expérimentale est illustré à la figure 1A. Le couvercle d’étalonnage (personnalisé), le couvercle d’endurance de nage (personnalisé) e…

Representative Results

Nous avons mis en place le tunnel de nage comme décrit à la section 1 de ce protocole (Figure 1). Nous avons évalué l’endurance à la nage (section 2 de ce protocole) ainsi que le comportement de nage (sections 3 et 4 de ce protocole) du poisson-zèbre adulte au départ et après une lésion de la moelle épinière (Figure 2). Pour établir la fonction motrice de base, nous avons examiné l’endurance à la nage du poisson-zèb…

Discussion

Le poisson-zèbre adulte est un système de vertébrés populaire pour modéliser les maladies humaines et étudier les mécanismes de régénération des tissus. L’édition du génome CRISPR/Cas9 a révolutionné les études génétiques inversées pour la modélisation des maladies chez le poisson-zèbre; cependant, la génétique à grande échelle chez le poisson-zèbre adulte a été entravée par des défis biologiques et techniques, y compris l’indisponibilité des tissus de poisson-zèbre adultes au phénotyp…

Materials

AutoSwim software	Loligo Systems	MI10000	Optional – for Automatic control of current velocity
Customized lid	Loligo Systems	MI10001	This customized lid is used for swim endurance
DAQ-BT	Loligo Systems	SW10600	Optional – for Automatic control of current velocity
Eheim pump	Loligo Systems	PU10160	20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank.
Fiji	Fiji	Freely available through Image J (Fiji)	Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Flowtherm	Loligo Systems	AC10000	Handheld digital flow meter – for calibration
High Speed Camera	Loligo Systems	VE10380	USB 3.0 color video camera (4MP)
IR light panel	Loligo Systems	VE10775	450 x 210 mm, placed under the swim tunnel  chamber
Monofocal lens	Loligo Systems	VE10388	25mm manual lens
PVC Tubing	VWR	60985-534	5/16 x 7/16"  Wall thickness: 1/16"
R Studio	R Studio	Freely available. Version 3.6 with extra packages.	Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Swim tunnel respirometer	Loligo Systems	SW10060	5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration
uEye Cockpit	IDS	Freely available software to control camera parameters	Alternative cameras and accompanying softwares could be used
Vane wheel flow probe	Loligo Systems	AC10002	Digital flow probe – for calibration