Vurdering av svømme utholdenhet og svømmeadferd i voksen sebrafisk

Summary

I stand til funksjonell utvinning etter ryggmargsskade, er voksen sebrafisk et førsteklasses modellsystem for å belyse medfødte mekanismer for nevral regenerering. Her beskriver vi svømme utholdenhet og svømmeadferd analyser som funksjonelle avlesninger av ryggmargsregenerering.

Abstract

På grunn av deres anerkjente regenerative kapasitet er voksen sebrafisk en førsteklasses virveldyrmodell for å forhøre mekanismer for medfødt ryggmargsregenerering. Etter fullstendig transeksjon av ryggmargen strekker sebrafisk glial- og axonalbroer over avkuttet vev, regenererer nevroner proksimalt til lesjonen, og gjenvinner svømmekapasiteten innen 8 uker etter skade. Gjenoppretting av svømmefunksjon er dermed en sentral avlesning for funksjonell ryggmargsreparasjon. Her beskriver vi et sett med atferdsanalyser for å kvantifisere sebrafiskmotorkapasitet inne i en lukket svømmetunnel. Målet med disse metodene er å gi kvantifiserbare målinger av svømme utholdenhet og svømmeadferd i voksen sebrafisk. For svømme utholdenhet blir sebrafisk utsatt for en stadig økende vannstrømhastighet til utmattelse, og tid ved utmattelse rapporteres. For vurdering av svømmeadferd blir sebrafisk utsatt for lave strømhastigheter og svømmevideoer er fanget med en dorsal visning av fisken. Prosentaktivitet, burstfrekvens og tid brukt mot vannstrømmen gir kvantifiserbare avlesninger av svømmeatferd. Vi kvantifiserte svømme utholdenhet og svømmeadferd i vill type sebrafisk før skade og etter ryggmargstranseksjon. Vi fant ut at sebrafisk mister svømmefunksjonen etter ryggmargstranseksjon og gradvis gjenvinner denne kapasiteten mellom 2 og 6 uker etter skade. Metodene beskrevet i denne studien kan brukes på nevrobehavioral, muskuloskeletal, skjelettmuskulaturregenerering og nevrale regenereringsstudier hos voksne sebrafisk.

Introduction

Voksen sebrafisk brukes eminent til å undersøke mekanismer for nevromuskulær og muskuloskeletal utvikling og sykdomsmodellering1,2,3. Sebrafisk er i stand til effektiv, spontan reparasjon av flere vev, inkludert hjernen, ryggmargen og skjelettmuskelen4,5,6,7. Den bemerkelsesverdige kapasiteten til å regenerere nevromuskulært vev og modellsykdommer tiltrekker seg et voksende vitenskapelig samfunn til voksen sebrafiskforskning1,2,3. Men mens analyser av bevegelse og svømmeadferd er tilgjengelig og standardisert for larval sebrafisk, er det et økende behov for å utvikle analoge protokoller i voksenfisk8,9,10,11. Målet med denne studien er å beskrive protokoller for å kvantifisere svømme utholdenhet og svømmeadferd i voksen sebrafisk. Vi presenterer disse protokollene i sammenheng med ryggmargsregenereringsforskning. Imidlertid er atferdsprotokollene beskrevet her like anvendelige for studier av nevral og muskelregenerering, nevromuskulær og muskuloskeletal utvikling, samt nevromuskulær og muskuloskeletal sykdomsmodellering.

Sebrafisk omvendt lammelse innen 8 uker etter fullstendig ryggmargstranseksjon. I motsetning til dårlig regenerative pattedyr, viser sebrafisk pro-regenerative immun-, nevronale og glial skaderesponser som kreves for funksjonell ryggmargsreparasjon12,13,14. En ultimate avlesning av funksjonell ryggmargsreparasjon er evnen til det lesjonerte vevet til å gjenvinne sin funksjon etter skade. En pakke med standardiserte metoder for å vurdere funksjonell regenerering hos gnagere inkluderer lokomotoriske, motoriske, sensoriske og sensoriske tester15,16,17. Mye brukt tester i musen ryggmargsskade inkluderer locomotor Basso Mouse Scale (BMS), forelimb motor tester, taktile sensoriske tester, og grid walking sensorimotoriske ^tester15,17. I motsetning til pattedyr- eller larval sebrafisksystemer er atferdstester i voksen sebrafisk mindre utviklet, men mye nødvendig for å imøtekomme de voksende behovene til vevsregenererings- og sykdomsmodelleringssamfunnene.

Komplette ryggmargstranseksjoner resulterer i fullstendig lammelse kaudal til skadestedet. Kort tid etter skaden er lammede dyr mindre aktive og unngår å svømme så mye som mulig. For å kompensere for tapt svømmekapasitet viser lammede dyr korte, hyppige brister ved å overbruke brystfinner, som ligger rostral til lesjonen. Denne kompenserende svømmestrategien resulterer i rask utmattelse og lavere svømmekapasitet. Når sebrafiskens ryggmarg regenererer, gjenvinner dyrene en jevn oscillatorisk svømmefunksjon caudal til lesjonen, noe som gir økt svømme utholdenhet og forbedrede svømmeadferdsparametere. Her beskriver vi metoder for å kvantifisere sebrafisk svømme utholdenhet ved å øke vannstrømmens hastigheter og svømmeadferd ved lave strømhastigheter.

Protocol

Voksen sebrafisk av Ekkwill- og AB-stammene ble opprettholdt ved Washington University Zebrafish Core Facility. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med IACUC institusjonelle dyreprotokoller. MERK: Et eksempel på det eksperimentelle oppsettet vises i figur 1A. Kalibreringslokket (tilpasset), utholdenhetslokket for svømming (tilpasset) og svømmeadferdslokket (standard, vedlagt tunnellokk) er vist i figur 1B. Den eksperimentelle ar…

Representative Results

Vi setter opp svømmetunnelen som beskrevet i avsnitt 1 i denne protokollen (figur 1). Vi vurderte svømme utholdenhet (avsnitt 2 i denne protokollen) samt svømmeadferd (avsnitt 3 og 4 i denne protokollen) av voksen sebrafisk ved baseline og etter ryggmargsskade (figur 2). For å etablere baseline motorfunksjon undersøkte vi svømme utholdenheten til villfisk under økende vannstrømhastigheter (figur 3A</strong…

Discussion

Voksen sebrafisk er et populært virveldyrsystem for modellering av menneskelige sykdommer og studiemekanismer for vevregenerering. CRISPR/Cas9 genomredigering har revolusjonert omvendt genetiske studier for modellering av sykdom hos sebrafisk; Imidlertid har storskala genetikk i voksen sebrafisk blitt hindret av biologiske og tekniske utfordringer, inkludert utilgjengeligheten av voksne sebrafiskvev til høygjennomstrømning fenotyping. Gitt den komplekse anatomien til voksen sebrafisk, er langvarig histologisk behandli…

Materials

AutoSwim software	Loligo Systems	MI10000	Optional – for Automatic control of current velocity
Customized lid	Loligo Systems	MI10001	This customized lid is used for swim endurance
DAQ-BT	Loligo Systems	SW10600	Optional – for Automatic control of current velocity
Eheim pump	Loligo Systems	PU10160	20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank.
Fiji	Fiji	Freely available through Image J (Fiji)	Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Flowtherm	Loligo Systems	AC10000	Handheld digital flow meter – for calibration
High Speed Camera	Loligo Systems	VE10380	USB 3.0 color video camera (4MP)
IR light panel	Loligo Systems	VE10775	450 x 210 mm, placed under the swim tunnel  chamber
Monofocal lens	Loligo Systems	VE10388	25mm manual lens
PVC Tubing	VWR	60985-534	5/16 x 7/16"  Wall thickness: 1/16"
R Studio	R Studio	Freely available. Version 3.6 with extra packages.	Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Swim tunnel respirometer	Loligo Systems	SW10060	5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration
uEye Cockpit	IDS	Freely available software to control camera parameters	Alternative cameras and accompanying softwares could be used
Vane wheel flow probe	Loligo Systems	AC10002	Digital flow probe – for calibration