Yetişkin Zebra Balıklarında Yüzme Dayanıklılığı ve Yüzme Davranışının Değerlendirilmesi
Summary
Omurilik yaralanmasından sonra fonksiyonel iyileşme yeteneğine sahip olan yetişkin zebra balığı, doğuştan gelen nöral rejenerasyon mekanizmalarını aydınlatmak için önde gelen bir model sistemidir. Burada, yüzme dayanıklılığını ve yüzme davranışı testlerini omurilik rejenerasyonunun fonksiyonel okumaları olarak tanımlıyoruz.
Abstract
Ünlü rejeneratif kapasiteleri nedeniyle, yetişkin zebra balığı, doğuştan gelen omurilik rejenerasyonunun mekanizmalarını sorgulamak için önde gelen bir omurgalı modelidir. Omuriliklerinin tamamen transeksiyonunu takiben, zebra balığı kopmuş doku boyunca glial ve aksonal köprüleri genişletir, lezyona proksimal nöronları yeniler ve yaralanmadan sonraki 8 hafta içinde yüzme kapasitelerini yeniden kazanırlar. Yüzme fonksiyonunun geri kazanılması bu nedenle fonksiyonel omurilik onarımı için merkezi bir okumadır. Burada, kapalı bir yüzme tüneli içindeki zebra balığı motor kapasitesini ölçmek için bir dizi davranışsal tahlil tarif ediyoruz. Bu yöntemlerin amacı, yetişkin zebra balıklarında yüzme dayanıklılığı ve yüzme davranışının ölçülebilir ölçümlerini sağlamaktır. Yüzme dayanıklılığı için, zebra balığı tükenene kadar sürekli artan bir su akımı hızına maruz kalır ve tükenme süresi bildirilir. Yüzme davranışı değerlendirmesi için, zebra balığı düşük akım hızlarına maruz bırakılır ve yüzme videoları balığın sırt görünümü ile yakalanır. Yüzde aktivitesi, patlama sıklığı ve su akımına karşı harcanan zaman, yüzme davranışının ölçülebilir okumalarını sağlar. Vahşi tip zebra balıklarında yaralanmadan önce ve omurilik transeksiyonundan sonra yüzme dayanıklılığını ve yüzme davranışını ölçtük. Zebra balıklarının omurilik transeksiyonundan sonra yüzme fonksiyonunu kaybettiğini ve yaralanma sonrası 2 ila 6 hafta arasında bu kapasiteyi kademeli olarak geri kazandığını bulduk. Bu çalışmada açıklanan yöntemler, yetişkin zebra balıklarında nörodavranışsal, kas-iskelet sistemi, iskelet kası rejenerasyonu ve nöral rejenerasyon çalışmalarına uygulanabilir.
Introduction
Yetişkin zebra balığı, nöromüsküler ve kas-iskelet sistemi gelişim mekanizmalarını ve hastalık modellemesini araştırmak için son derece kullanılır1,2,3. Zebra balığı, beyin, omurilik ve iskelet kası dahil olmak üzere birçok dokunun etkili, kendiliğinden onarımını yapabilir4,5,6,7. Nöromüsküler dokuları yenilemek ve hastalıkları modellemek için olağanüstü kapasite, büyüyen bir bilimsel topluluğu yetişkin zebra balığı araştırmalarına çekmektedir1,2,3. Bununla birlikte, larva zebra balığı için hareket ve yüzme davranışı tahlilleri mevcut ve standartlaştırılmış olsa da, yetişkin balıklarda benzer protokoller geliştirmeye yönelik artan bir ihtiyaç vardır8,9,10,11. Bu çalışmanın amacı, yetişkin zebra balıklarında yüzme dayanıklılığını ve yüzme davranışını ölçmek için protokolleri tanımlamaktır. Bu protokolleri omurilik rejenerasyonu araştırmaları bağlamında sunuyoruz. Bununla birlikte, burada açıklanan davranışsal protokoller, nöral ve kas rejenerasyonu, nöromüsküler ve kas-iskelet sistemi gelişiminin yanı sıra nöromüsküler ve kas-iskelet sistemi hastalık modellemesi çalışmalarına eşit derecede uygulanabilir.
Zebra balığı, tam omurilik transeksiyonundan sonraki 8 hafta içinde felci tersine çevirir. Kötü rejeneratif memelilerin aksine, zebra balığı fonksiyonel omurilik onarımı için gerekli olan pro-rejeneratif immün, nöronal ve glial yaralanma yanıtlarını gösterir12,13,14. Fonksiyonel omurilik onarımının nihai bir okuması, lezyonlu dokunun yaralanma sonrası işlevini yeniden kazanma yeteneğidir. Kemirgenlerde fonksiyonel rejenerasyonu değerlendirmek için bir dizi standartlaştırılmış yöntem lokomotor, motor, duyusal ve sensorimotor testleri içerir15,16,17. Fare omurilik yaralanmasında yaygın olarak kullanılan testler arasında lokomotor Basso Fare Skalası (BMS), ön ayak motor testleri, dokunsal duyusal testler ve ızgara yürüme sensorimotor testleri bulunmaktadır15,17. Memeli veya larva zebra balığı sistemlerinin aksine, yetişkin zebra balıklarında davranışsal testler daha az gelişmiştir, ancak doku yenilenmesi ve hastalık modelleme topluluklarının artan ihtiyaçlarını karşılamak için çok ihtiyaç duyulmaktadır.
Tam omurilik transeksiyonları, yaralanma bölgesine tam felç kaudal ile sonuçlanır. Yaralanmadan kısa bir süre sonra, felçli hayvanlar daha az aktiftir ve mümkün olduğunca yüzmekten kaçınırlar. Kayıp yüzme kapasitesini telafi etmek için, felçli hayvanlar, lezyona rostral olarak uzanan pektoral yüzgeçlerini aşırı kullanarak kısa, sık sık patlamalar gösterirler. Bu telafi edici yüzme stratejisi, hızlı tükenme ve daha düşük yüzme kapasitesi ile sonuçlanır. Zebra balığı omuriliği yenilendikçe, hayvanlar lezyona kaudal olarak pürüzsüz bir salınımlı yüzme fonksiyonu kazanırlar, bu da yüzme dayanıklılığının artmasına ve yüzme davranışı parametrelerinin iyileştirilmesine olanak tanır. Burada, zebra balıklarının artan su akım hızlarında yüzme dayanıklılığını ve düşük akım hızlarında yüzme davranışını ölçmek için yöntemler açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yetişkin zebra balığı, insan hastalıklarını modellemek ve doku rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için popüler bir omurgalı sistemidir. CRISPR / Cas9 genom düzenlemesi, zebra balıklarında hastalığın modellenmesi için ters genetik çalışmalarda devrim yarattı; Bununla birlikte, yetişkin zebra balıklarında büyük ölçekli genetik, yetişkin zebra balığı dokularının yüksek verimli fenotiplemeye uygun olmaması da dahil olmak üzere biyolojik ve teknik zorluklar nedeniyle engellenmiştir….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hayvan bakımı için Washington Üniversitesi Zebra Balığı Ortak Kaynağına teşekkür ederiz. Bu araştırma NIH (R01 NS113915 ila M.H.M.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter – for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe – for calibration |
Referências
- Becker, C. G., Becker, T. Neuronal regeneration from ependymo-radial glial cells: cook, little pot, cook. Developmental Cell. 32 (4), 516-527 (2015).
- Mokalled, M. H., Poss, K. D. A regeneration toolkit. Developmental Cell. 47 (3), 267-280 (2018).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmental Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
- Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (23), 10545-10549 (1995).
- Moens, C. B., Yan, Y. L., Appel, B., Force, A. G., Kimmel, C. B. Valentino: a zebrafish gene required for normal hindbrain segmentation. Development. 122 (12), 3981-3990 (1996).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Klatt Shaw, D., et al. Localized EMT reprograms glial progenitors to promote spinal cord repair. Developmental Cell. 56 (5), 613-626 (2021).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Scheff, S. W., Saucier, D. A., Cain, M. E. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score. Journal of Neurotrauma. 19 (10), 1251-1260 (2002).
- Li, Q., et al. Differential behavioral responses of zebrafish larvae to yohimbine treatment. Psychopharmacology (Berl). 232 (1), 197-208 (2015).
- Wakamatsu, Y., Ogino, K., Hirata, H. Swimming capability of zebrafish is governed by water temperature, caudal fin length and genetic background. Scientific Reports. 9 (1), 16307 (2019).
- Ahmed, O., Seguin, D., Gerlai, R. An automated predator avoidance task in zebrafish. Behavioral Brain Research. 216 (1), 166-171 (2011).
- Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 87 (5), 1219-1233 (2015).
- Leris, I., Sfakianakis, D. G., Kentouri, M. Are zebrafish Danio rerio males better swimmers than females. Journal of Fish Biology. 83 (5), 1381-1386 (2013).
