يتم وصف منهجية تصوير رامان المتناثرة المتماسكة لتصور وقياس المركبات الصيدلانية داخل الجلد. تصف هذه الورقة إعداد أنسجة الجلد (الإنسان والفأر) وتطبيق التركيبة الموضعية ، والحصول على الصور لتحديد ملامح التركيز الزماني المكاني ، والتحليل الدوائي الأولي لتقييم توصيل الأدوية الموضعية.
كانت الحرائك الدوائية الجلدية (cPK) بعد تطبيق التركيبة الموضعية مجالا بحثيا ذا أهمية خاصة للعلماء التنظيميين وتطوير الأدوية لفهم التوافر البيولوجي الموضعي (BA) ميكانيكيا. التقنيات شبه الغازية ، مثل تجريد الشريط ، أو غسيل الكلى المجهري الجلدي ، أو التروية الدقيقة الجلدية مفتوحة التدفق ، كلها تحدد كمية cPK على نطاق كبير. في حين أن هذه التقنيات قد وفرت معرفة واسعة ب cPK ، إلا أن المجتمع يفتقر إلى فهم ميكانيكي لاختراق المكونات الصيدلانية النشطة (API) ونفاذيتها على المستوى الخلوي.
أحد الأساليب غير الباضعة لمعالجة cPK المجهري هو تصوير رامان المتماسك (CRI) ، والذي يستهدف بشكل انتقائي الاهتزازات الجزيئية الجوهرية دون الحاجة إلى ملصقات خارجية أو تعديل كيميائي. لدى CRI طريقتان رئيسيتان – تشتت رامان المضاد ل Stokes (CARS) وتشتت Raman المحفز (SRS) – اللذان يمكنان من تحديد كمي حساس وانتقائي لواجهات برمجة التطبيقات أو المكونات غير النشطة. يستخدم CARS عادة لاشتقاق معلومات الجلد الهيكلية أو تصور التباين الكيميائي. في المقابل ، يتم استخدام إشارة SRS ، وهي خطية ذات تركيز جزيئي ، لتحديد واجهات برمجة التطبيقات أو المكونات غير النشطة داخل طبقات الجلد.
على الرغم من أن أنسجة الفئران قد استخدمت عادة ل cPK مع CRI ، إلا أنه يجب في نهاية المطاف تقييم BA الموضعي والتكافؤ الحيوي (BE) في الأنسجة البشرية قبل الموافقة التنظيمية. تقدم هذه الورقة منهجية لإعداد وتصوير الجلد خارج الجسم الحي لاستخدامها في دراسات CRI الحركية الدوائية الكمية في تقييم BA و BE الموضعية. تتيح هذه المنهجية تحديد كمية API الموثوقة والقابلة للتكرار داخل جلد الإنسان والفأر بمرور الوقت. يتم تحديد التركيزات داخل المقصورات الغنية بالدهون والفقيرة بالدهون ، وكذلك تركيز API الكلي بمرور الوقت ؛ وتستخدم هذه لتقديرات بكالوريوس الجزئي والكلي، وربما BE.
وقد توسعت منهجيات تقييم cPK بعد تطبيق منتج الدواء الموضعي من الدراسات الكلاسيكية لاختبار النفاذية في المختبر (IVPT)1،2،3،4،5 وتجريد الشريط6،7،8 إلى منهجيات إضافية مثل التروية الدقيقة مفتوحة التدفق أو غسيل الكلى المجهري الجلدي9،10،11 ، 12,13,14. من المحتمل أن تكون هناك مواقع محلية مختلفة للعمل العلاجي اعتمادا على المرض محل الاهتمام. وبالتالي ، قد يكون هناك عدد مماثل من المنهجيات لتقييم معدل ومدى وصول واجهة برمجة التطبيقات إلى موقع العمل المحلي المقصود. في حين أن كل منهجية من المنهجيات المذكورة أعلاه لها مزاياها ، فإن العيب الرئيسي هو عدم وجود معلومات cPK على نطاق دقيق (أي عدم القدرة على تصور أين تذهب واجهة برمجة التطبيقات وكيف تتغلغل).
إحدى المنهجيات غير الباضعة التي تهم تقدير BA و BE الموضعية هي CRI ، والتي يمكن تقسيمها إلى طريقتين للتصوير: CARS و SRS microscopy. تتيح طرق رامان المتماسكة هذه تصويرا كيميائيا محددا للجزيئات عبر تأثيرات رامان غير الخطية. في CRI ، يتم تركيز اثنين من قطارات نبض الليزر ومسحها ضوئيا داخل عينة. يتم تعيين الفرق في الطاقة بين ترددات الليزر لاستهداف أوضاع الاهتزاز الخاصة بالهياكل الكيميائية ذات الاهتمام. نظرا لأن عمليات CRI غير خطية ، يتم إنشاء إشارة فقط عند تركيز المجهر ، مما يسمح بالتصوير المقطعي الدوائي ثلاثي الأبعاد للأنسجة. في سياق cPK ، تم استخدام CARS للحصول على معلومات هيكلية للأنسجة ، مثل موقع هياكل الجلد الغنية بالدهون15. في المقابل ، تم استخدام SRS لتحديد التركيز الجزيئي كميا لأن إشارته خطية مع تركيز. بالنسبة لعينات الجلد خارج الجسم الحي ، من المفيد تنفيذ CARS في الاتجاه epi-direction16 و SRS في وضع الإرسال17. لذلك ، فإن عينات الأنسجة الرقيقة ستسمح باكتشاف إشارة SRS وتحديدها كميا.
كنسيج نموذجي ، تقدم أذن الفأر العارية العديد من المزايا مع عيوب طفيفة. إحدى المزايا هي أن الأنسجة هي بالفعل ~ 200-300 ميكرومتر في السمك ولا تتطلب المزيد من إعداد العينات. بالإضافة إلى ذلك ، يتم رؤية العديد من الطبقات الجلدية من خلال التركيز المحوري من خلال مجال رؤية واحد (على سبيل المثال ، الطبقة القرنية ، الغدد الدهنية (SGs) ، الخلايا الشحمية ، والدهون تحت الجلد) 16،18. وهذا يسمح بالتقدير الأولي قبل السريري لمسارات النفاذية الجلدية وتقديرات BA الموضعية قبل الانتقال إلى عينات الجلد البشري. ومع ذلك ، فإن نموذج الماوس العاري يقدم قيودا مثل صعوبة الاستقراء إلى سيناريوهات في الجسم الحي بسبب الاختلافات في بنية الجلد19. في حين أن أذن الفأر العارية هي نموذج ممتاز للحصول على نتائج أولية ، فإن نموذج الجلد البشري هو المعيار الذهبي. على الرغم من وجود العديد من التعليقات حول مدى ملاءمة وقابلية تطبيق الجلد البشري المتجمد لتلخيص حركية نفاذية الجسم الحي بدقة 20،21،22 ، فإن استخدام الجلد البشري المتجمد هو طريقة مقبولة لتقييم حركية نفاذية API في المختبر 23،24،25 . يتصور هذا البروتوكول طبقات الجلد المختلفة في جلد الفأر والإنسان مع تحديد تركيزات API داخل الهياكل الغنية بالدهون والفقيرة بالدهون.
في حين تم استخدام CRI عبر العديد من المجالات لتصور المركبات داخل الأنسجة على وجه التحديد ، كانت هناك جهود محدودة للتحقيق في cPK للمنتجات الدوائية المطبقة موضعيا. لتقييم BA/BE الموضعي للمنتجات الموضعية باستخدام CRI، من الضروري أولا وجود بروتوكول موحد لإجراء مقارنات دقيقة. وقد أظهرت الجهود السابقة باستخدام CRI لتوصيل الأدوية إلى الجلد تباينا داخل البيانات. نظرا لأن هذا تطبيق جديد نسبيا ل CRI ، فإن إنشاء بروتوكول أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج موثوقة18،26،27. يستهدف هذا النهج رقما موجيا محددا واحدا فقط في المنطقة الصامتة بيولوجيا من طيف رامان. ومع ذلك ، فإن معظم واجهات برمجة التطبيقات والمكونات غير النشطة لها تحولات رامان داخل منطقة بصمات الأصابع. وقد شكل هذا في السابق تحديات بسبب الإشارة المتأصلة الناشئة عن الأنسجة في منطقة بصمات الأصابع. وقد أزالت التطورات الحديثة في الليزر والحوسبة هذا الحاجز ، والذي يمكن استخدامه أيضا بالاقتران مع النهج المعروض هنا28. يسمح هذا النهج المعروض هنا بالتحديد الكمي لواجهة برمجة التطبيقات ، والتي لديها تحول رامان في المنطقة الصامتة (2000-2300 سم – 1). هذا لا يقتصر على الخصائص الفيزيائية الكيميائية للدواء ، والتي قد يكون هذا هو الحال بالنسبة لبعض منهجيات مراقبة cPK المذكورة سابقا29.
يجب أن يقلل البروتوكول من التباين من عينة إلى عينة في سمك الجلد لمختلف المستحضرات ، حيث أن عينات الجلد البشري السميك ستنتج الحد الأدنى من الإشارة بعد تطبيق منتج الدواء بسبب تشتت الضوء بواسطة العينة السميكة. الهدف من هذه المخطوطة هو تقديم منهجية لإعداد الأنسجة تضمن معايير التصوير القابلة للتكرار. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إعداد نظام CRI كما هو موضح لتقليل مصادر الخطأ المحتملة وكذلك تقليل الإشارة إلى الضوضاء. ومع ذلك ، لن تناقش هذه الورقة المبادئ التوجيهية والمزايا التقنية لمجهر CRI حيث تم تغطية ذلك سابقا30. وأخيرا، يتم استكشاف إجراء تحليل البيانات الشامل للسماح بتفسير النتائج لتحديد نجاح التجربة أو فشلها.
تقييم BA/BE الموضعي هو مجال للبحث يتطلب نهجا متعدد الأوجه حيث لا يمكن لأي طريقة واحدة أن تميز بشكل كامل في الجسم الحي cPK. يقدم هذا البروتوكول منهجية لتقييم BA/BE لمنتج دوائي موضعي استنادا إلى تصوير رامان المتماسك. واحدة من النقاط الأولى التي يمكن تجاهلها هي مدى رقة عينات الجلد ، خاصة بالنسب…
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفان أن يشكرا الدكتور فوتيس إليوبولوس ودانيال غرينفيلد من مجموعة إيفانز على مناقشتهما وتدقيقهما لهذه المخطوطة. وبالإضافة إلى ذلك، يود المؤلفون أن ينوه بالدعم المقدم من LEO Pharma. تم إنشاء الشكل 2 باستخدام BioRender.com.
Tissue Preparation | |||
Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
Laser/microscope | |||
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter – CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter – deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m |
|
DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser |
|
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 |
|
FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation |
|
SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ |
|
Lipid/Drug Imaging | |||
35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= |
|
Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true |
|
Data Analysis | |||
FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ |
|
Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ |
|
Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |