Визуализация и количественная оценка фармацевтических соединений в коже с помощью когерентной рамановской рассеянной визуализации
Summary
Описана когерентная методология визуализации рамановского рассеяния для визуализации и количественной оценки фармацевтических соединений в коже. В данной работе описывается подготовка тканей кожи (человека и мыши) и местное применение состава, получение изображений для количественной оценки профилей пространственно-временной концентрации и предварительный фармакокинетический анализ для оценки местной доставки лекарств.
Abstract
Кожная фармакокинетика (cPK) после местного применения состава была областью исследований, представляющей особый интерес для ученых в области регулирования и разработки лекарств для механистического понимания местной биодоступности (BA). Полуинвазивные методы, такие как ленточное удаление, дермальный микродиализ или кожная микроперфузия с открытым потоком, количественно определяют макромасштаб cPK. Хотя эти методы предоставили обширные знания cPK, сообществу не хватает механистического понимания проникновения и проникновения активных фармацевтических ингредиентов (API) на клеточном уровне.
Одним из неинвазивных подходов к решению микромасштабных cPK является когерентная рамановская рассеянная визуализация (CRI), которая избирательно нацелена на внутренние молекулярные колебания без необходимости внешних меток или химической модификации. CRI имеет два основных метода – когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние (CARS) и стимулированное рамановское рассеяние (SRS), которые позволяют чувствительную и селективную количественную оценку API или неактивных ингредиентов. CARS обычно используется для получения структурной информации о коже или визуализации химического контраста. Напротив, сигнал SRS, который является линейным с молекулярной концентрацией, используется для количественной оценки API или неактивных ингредиентов в стратификациях кожи.
Хотя ткань мыши обычно используется для cPK с CRI, местный BA и биоэквивалентность (BE) в конечном итоге должны быть оценены в тканях человека до одобрения регулирующих органов. В данной статье представлена методология подготовки и изображения кожи ex vivo для использования в количественных фармакокинетических исследованиях CRI при оценке актуальных БА и БЭ. Эта методология обеспечивает надежную и воспроизводимую количественную оценку API в коже человека и мыши с течением времени. Количественно оцениваются концентрации в богатых липидами и бедных липидами компартментах, а также общая концентрация АФИ с течением времени; они используются для оценки микро- и макромасштабных БА и, возможно, БЭ.
Introduction
Методологии оценки cPK после местного применения лекарственного средства расширились от классических исследований проникновения in vitro (IVPT) 1,2,3,4,5 и ленточного удаления 6,7,8 до дополнительных методологий, таких как микроперфузия с открытым потоком или дермальный микродиализ 9,10,11, 12,13,14. Существуют потенциально различные локальные участки терапевтического действия в зависимости от интересующего заболевания. Следовательно, может существовать соответствующее количество методологий для оценки скорости и степени, в которой API попадает на предполагаемый локальный сайт действий. Хотя каждая из вышеупомянутых методологий имеет свои преимущества, основным недостатком является отсутствие микромасштабной информации cPK (то есть невозможность визуализировать, куда идет API и как он пронизывает).
Одной из неинвазивных методологий, представляющих интерес для оценки актуальных БА и БЭ, является CRI, который можно разбить на два метода визуализации: CARS и микроскопию SRS. Эти когерентные рамановские методы позволяют химически специфическую визуализацию молекул с помощью нелинейных рамановских эффектов. В CRI две лазерные импульсные цепи фокусируются и сканируются внутри образца; разница в энергии между частотами лазера устанавливается для нацеливания на колебательные моды, специфичные для химических структур, представляющих интерес. Поскольку процессы CRI нелинейны, сигнал генерируется только в фокусе микроскопа, что позволяет проводить трехмерную фармакокинетическую томографическую визуализацию ткани. В контексте cPK CARS был использован для получения тканевой структурной информации, такой как расположение богатых липидами структур кожи15. Напротив, SRS был использован для количественной оценки молекулярной концентрации, поскольку ее сигнал является линейным с концентрацией. Для образцов кожи ex vivo предпочтительно проводить CARS в эпи-направлении16 и SRS в режиме передачи17. Таким образом, тонкие образцы тканей позволят обнаруживать и количественно определять сигнал SRS.
Как модельная ткань, ухо обнаженной мыши представляет несколько преимуществ с незначительными недостатками. Одним из преимуществ является то, что ткань уже имеет толщину ~200-300 мкм и не требует дальнейшей пробоподготовки. Кроме того, несколько стратификаций кожи наблюдаются путем осевой фокусировки через одно поле зрения (например, роговой слой, сальные железы (SGs), адипоциты и подкожный жир)16,18. Это позволяет проводить предварительную доклиническую оценку путей кожного проникновения и актуальные оценки БА перед переходом к образцам кожи человека. Однако модель обнаженной мыши имеет такие ограничения, как сложность экстраполяции на сценарии in vivo из-за различий в структуре кожи19. В то время как обнаженное ухо мыши является отличной моделью для получения предварительных результатов, модель кожи человека является золотым стандартом. Хотя были различные комментарии о пригодности и применимости замороженной кожи человека для точного повторения кинетики проникновения in vivo 20,21,22, использование замороженной кожи человека является общепринятым методом оценки кинетики проникновения API in vitro 23,24,25 . Этот протокол визуализирует различные слои кожи мыши и человека, количественно оценивая концентрации API в богатых липидами и бедных липидами структурах.
В то время как CRI использовался во многих областях для конкретной визуализации соединений в тканях, были предприняты ограниченные усилия по исследованию cPK местно применяемых лекарственных средств. Чтобы оценить актуальный BA / BE актуальных продуктов с использованием CRI, необходимо сначала иметь стандартизированный протокол для проведения точных сравнений. Предыдущие усилия по использованию CRI для доставки лекарств на кожу продемонстрировали изменчивость данных. Поскольку это относительно новое применение CRI, создание протокола имеет решающее значение для получения надежных результатов 18,26,27. Этот подход нацелен только на одно конкретное волновое число в биологической тихой области рамановского спектра. Однако большинство API и неактивных ингредиентов имеют рамановские сдвиги в области отпечатков пальцев. Ранее это создавало проблемы из-за внутреннего сигнала, возникающего из ткани в области отпечатков пальцев. Последние лазерные и вычислительные достижения устранили этот барьер, который также может быть использован в сочетании с подходом, представленным здесь28. Этот подход, представленный здесь, позволяет количественно оценить API, который имеет рамановский сдвиг в тихой области (2000-2 300 см-1). Это не ограничивается физико-химическими свойствами препарата, что может иметь место для некоторых ранее упомянутых методологий мониторинга cPK29.
Протокол должен уменьшать вариабельность толщины кожи от образца к образцу для различных препаратов, поскольку образцы толстой кожи человека будут производить минимальный сигнал после применения лекарственного препарата из-за рассеяния света толстым образцом. Целью этой рукописи является представление методологии подготовки тканей, которая обеспечивает воспроизводимые стандарты визуализации. Кроме того, система CRI настроена так, как описано, чтобы уменьшить потенциальные источники ошибок, а также минимизировать сигнал-шум. Однако в этом документе не будут обсуждаться руководящие принципы и технические достоинства микроскопа CRI, поскольку это было ранее рассмотрено30. Наконец, исследуется обширная процедура анализа данных, позволяющая интерпретировать результаты для определения успеха или неудачи эксперимента.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оценка актуального BA/BE является областью исследований, требующей многогранного подхода, поскольку ни один метод не может полностью охарактеризовать in vivo cPK. В этом протоколе представлена методология оценки BA/BE местного лекарственного препарата на основе когерентной рамановской ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Фотиса Илиопулоса и Дэниела Гринфилда из Группы Эванса за обсуждение и корректуру этой рукописи. Кроме того, авторы хотели бы отметить поддержку со стороны LEO Pharma. Рисунок 2 был создан с помощью BioRender.com.
Materials
| Tissue Preparation | |||
| Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
| Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
| Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
| High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
| Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
| Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
| Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
| Laser/microscope | |||
| 650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter – CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
| Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
| D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter – deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m |
|
| DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser |
|
| Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
| Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 |
|
| FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
| Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
| Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
| ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation |
|
| SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
| SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
| UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ |
|
| Lipid/Drug Imaging | |||
| 35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
| Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
| Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= |
|
| Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true |
|
| Data Analysis | |||
| FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ |
|
| Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ |
|
| Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |
References
- Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J., Benson, H. E., Watkinson, A. C. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. , 85-108 (2012).
- Shin, S. H., et al. On the road to development of an in vitro permeation test (IVPT) model to compare heat effects on transdermal delivery systems: exploratory studies with nicotine and fentanyl. Pharmaceutical Research. 34 (9), 1817-1830 (2017).
- Hossain, A., et al. Preparation, characterisation, and topical delivery of terbinafine. Pharmaceutics. 11 (10), 548 (2019).
- Santos, L. L., Swofford, N. J., Santiago, B. G. In vitro permeation test (IVPT) for pharmacokinetic assessment of topical dermatological formulations. Current Protocols in Pharmacology. 91 (1), 79 (2020).
- Iliopoulos, F., Caspers, P. J., Puppels, G. J., Lane, M. E. Franz cell diffusion testing andquantitative confocal Raman spectroscopy: In vitro-in vivo correlation. Pharmaceutics. 12 (9), 887 (2020).
- Cordery, S., et al. Topical bioavailability of diclofenac from locally-acting, dermatological formulations. International Journal of Pharmaceutics. 529 (1-2), 55-64 (2017).
- Pensado, A., et al. Stratum corneum sampling to assess bioequivalence between topicalacyclovir products. Pharmaceutical Research. 36 (12), 1-16 (2019).
- Zhang, Y., et al. Dermal delivery of niacinamide-in vivo studies. Pharmaceutics. 13 (5), 726 (2021).
- Bodenlenz, M., et al. Open flow microperfusion as a dermal pharmacokinetic approach to evaluate topical bioequivalence. Clinical Pharmacokinetics. 56 (1), 91-98 (2017).
- Eirefelt, S., et al. Evaluating dermal pharmacokinetics and pharmacodymanic effect of soft topical PDE4 inhibitors:Open flow microperfusion and skin biopsies. Pharmaceutical Research. 37 (12), 1-12 (2020).
- Stagni, G., O’Donnell, D., Liu, Y. J., Kellogg, J. D. L., Shepherd, A. M. Iontophoretic current and intradermal microdialysis recovery in humans. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 49-54 (1999).
- Garcia Ortiz, P., Hansen, S. H., Shah, V. P., Menne, T., Benfeldt, E. Impact of adultatopic dermatitis on topical drug penetration: assessment by cutaneous microdialysis and tape stripping. Acta Dermato-Venereologica. 89 (1), 33-38 (2009).
- Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).
- Kuzma, B. A., et al. Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741 (2021).
- Begley, R., Harvey, A., Byer, R. L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy. Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).
- Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).
- Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
- Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning. Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).
- Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin. Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).
- Nielsen, J. B., Plasencia, I., Sørensen, J. A., Bagatolli, L. Storage conditions of skin affect tissue structure and subsequent in vitro percutaneous penetration. Skin Pharmacology and Physiology. 24 (2), 93-102 (2011).
- Barbero, A. M., Frasch, H. F. Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds. Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).
- Babu, R., et al. The influence of various methods of cold storage of skin on the permeation of melatonin and nimesulide. Journal of Controlled Release. 86 (1), 49-57 (2003).
- Skelly, J. P., et al. FDA and AAPS report of the workshop on principles and practices of in vitro percutaneous penetration studies: relevance to bioavailability and bioequivalence. Pharmaceutical Research. 4 (3), 265-267 (1987).
- OECD. Guidance document for the conduct of skin absorption studies. OECD. , (2004).
- OECD. Test no. 428: Skin absorption: In vitro method. OECD. , (2004).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
- Herkenne, C., et al. In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability. Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).
- Alfonso-Garcıa, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Osseiran, S., et al. Longitudinal monitoring of cancer cell subpopulations in monolayers, 3D spheroids, and xenografts using the photoconvertible dye DiR. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
- Evennett, P. Kohler illumination: a simple interpretation. Proceedings of the Royal Microscopical Society. 28 (4), 189-192 (1983).
- Sanderson, J. Fundamentals of microscopy. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (2), 76 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hunter, J. D. Matplotlib: A 2D graphics environment. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).
- Wickham, H. . ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , (2016).
- Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. Development of R packages:’Non-Compart’ and ‘ncar’ for noncompartmental analysis (NCA). Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).
