Описана когерентная методология визуализации рамановского рассеяния для визуализации и количественной оценки фармацевтических соединений в коже. В данной работе описывается подготовка тканей кожи (человека и мыши) и местное применение состава, получение изображений для количественной оценки профилей пространственно-временной концентрации и предварительный фармакокинетический анализ для оценки местной доставки лекарств.
Кожная фармакокинетика (cPK) после местного применения состава была областью исследований, представляющей особый интерес для ученых в области регулирования и разработки лекарств для механистического понимания местной биодоступности (BA). Полуинвазивные методы, такие как ленточное удаление, дермальный микродиализ или кожная микроперфузия с открытым потоком, количественно определяют макромасштаб cPK. Хотя эти методы предоставили обширные знания cPK, сообществу не хватает механистического понимания проникновения и проникновения активных фармацевтических ингредиентов (API) на клеточном уровне.
Одним из неинвазивных подходов к решению микромасштабных cPK является когерентная рамановская рассеянная визуализация (CRI), которая избирательно нацелена на внутренние молекулярные колебания без необходимости внешних меток или химической модификации. CRI имеет два основных метода – когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние (CARS) и стимулированное рамановское рассеяние (SRS), которые позволяют чувствительную и селективную количественную оценку API или неактивных ингредиентов. CARS обычно используется для получения структурной информации о коже или визуализации химического контраста. Напротив, сигнал SRS, который является линейным с молекулярной концентрацией, используется для количественной оценки API или неактивных ингредиентов в стратификациях кожи.
Хотя ткань мыши обычно используется для cPK с CRI, местный BA и биоэквивалентность (BE) в конечном итоге должны быть оценены в тканях человека до одобрения регулирующих органов. В данной статье представлена методология подготовки и изображения кожи ex vivo для использования в количественных фармакокинетических исследованиях CRI при оценке актуальных БА и БЭ. Эта методология обеспечивает надежную и воспроизводимую количественную оценку API в коже человека и мыши с течением времени. Количественно оцениваются концентрации в богатых липидами и бедных липидами компартментах, а также общая концентрация АФИ с течением времени; они используются для оценки микро- и макромасштабных БА и, возможно, БЭ.
Методологии оценки cPK после местного применения лекарственного средства расширились от классических исследований проникновения in vitro (IVPT) 1,2,3,4,5 и ленточного удаления 6,7,8 до дополнительных методологий, таких как микроперфузия с открытым потоком или дермальный микродиализ 9,10,11, 12,13,14. Существуют потенциально различные локальные участки терапевтического действия в зависимости от интересующего заболевания. Следовательно, может существовать соответствующее количество методологий для оценки скорости и степени, в которой API попадает на предполагаемый локальный сайт действий. Хотя каждая из вышеупомянутых методологий имеет свои преимущества, основным недостатком является отсутствие микромасштабной информации cPK (то есть невозможность визуализировать, куда идет API и как он пронизывает).
Одной из неинвазивных методологий, представляющих интерес для оценки актуальных БА и БЭ, является CRI, который можно разбить на два метода визуализации: CARS и микроскопию SRS. Эти когерентные рамановские методы позволяют химически специфическую визуализацию молекул с помощью нелинейных рамановских эффектов. В CRI две лазерные импульсные цепи фокусируются и сканируются внутри образца; разница в энергии между частотами лазера устанавливается для нацеливания на колебательные моды, специфичные для химических структур, представляющих интерес. Поскольку процессы CRI нелинейны, сигнал генерируется только в фокусе микроскопа, что позволяет проводить трехмерную фармакокинетическую томографическую визуализацию ткани. В контексте cPK CARS был использован для получения тканевой структурной информации, такой как расположение богатых липидами структур кожи15. Напротив, SRS был использован для количественной оценки молекулярной концентрации, поскольку ее сигнал является линейным с концентрацией. Для образцов кожи ex vivo предпочтительно проводить CARS в эпи-направлении16 и SRS в режиме передачи17. Таким образом, тонкие образцы тканей позволят обнаруживать и количественно определять сигнал SRS.
Как модельная ткань, ухо обнаженной мыши представляет несколько преимуществ с незначительными недостатками. Одним из преимуществ является то, что ткань уже имеет толщину ~200-300 мкм и не требует дальнейшей пробоподготовки. Кроме того, несколько стратификаций кожи наблюдаются путем осевой фокусировки через одно поле зрения (например, роговой слой, сальные железы (SGs), адипоциты и подкожный жир)16,18. Это позволяет проводить предварительную доклиническую оценку путей кожного проникновения и актуальные оценки БА перед переходом к образцам кожи человека. Однако модель обнаженной мыши имеет такие ограничения, как сложность экстраполяции на сценарии in vivo из-за различий в структуре кожи19. В то время как обнаженное ухо мыши является отличной моделью для получения предварительных результатов, модель кожи человека является золотым стандартом. Хотя были различные комментарии о пригодности и применимости замороженной кожи человека для точного повторения кинетики проникновения in vivo 20,21,22, использование замороженной кожи человека является общепринятым методом оценки кинетики проникновения API in vitro 23,24,25 . Этот протокол визуализирует различные слои кожи мыши и человека, количественно оценивая концентрации API в богатых липидами и бедных липидами структурах.
В то время как CRI использовался во многих областях для конкретной визуализации соединений в тканях, были предприняты ограниченные усилия по исследованию cPK местно применяемых лекарственных средств. Чтобы оценить актуальный BA / BE актуальных продуктов с использованием CRI, необходимо сначала иметь стандартизированный протокол для проведения точных сравнений. Предыдущие усилия по использованию CRI для доставки лекарств на кожу продемонстрировали изменчивость данных. Поскольку это относительно новое применение CRI, создание протокола имеет решающее значение для получения надежных результатов 18,26,27. Этот подход нацелен только на одно конкретное волновое число в биологической тихой области рамановского спектра. Однако большинство API и неактивных ингредиентов имеют рамановские сдвиги в области отпечатков пальцев. Ранее это создавало проблемы из-за внутреннего сигнала, возникающего из ткани в области отпечатков пальцев. Последние лазерные и вычислительные достижения устранили этот барьер, который также может быть использован в сочетании с подходом, представленным здесь28. Этот подход, представленный здесь, позволяет количественно оценить API, который имеет рамановский сдвиг в тихой области (2000-2 300 см-1). Это не ограничивается физико-химическими свойствами препарата, что может иметь место для некоторых ранее упомянутых методологий мониторинга cPK29.
Протокол должен уменьшать вариабельность толщины кожи от образца к образцу для различных препаратов, поскольку образцы толстой кожи человека будут производить минимальный сигнал после применения лекарственного препарата из-за рассеяния света толстым образцом. Целью этой рукописи является представление методологии подготовки тканей, которая обеспечивает воспроизводимые стандарты визуализации. Кроме того, система CRI настроена так, как описано, чтобы уменьшить потенциальные источники ошибок, а также минимизировать сигнал-шум. Однако в этом документе не будут обсуждаться руководящие принципы и технические достоинства микроскопа CRI, поскольку это было ранее рассмотрено30. Наконец, исследуется обширная процедура анализа данных, позволяющая интерпретировать результаты для определения успеха или неудачи эксперимента.
Оценка актуального BA/BE является областью исследований, требующей многогранного подхода, поскольку ни один метод не может полностью охарактеризовать in vivo cPK. В этом протоколе представлена методология оценки BA/BE местного лекарственного препарата на основе когерентной рамановской ?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Фотиса Илиопулоса и Дэниела Гринфилда из Группы Эванса за обсуждение и корректуру этой рукописи. Кроме того, авторы хотели бы отметить поддержку со стороны LEO Pharma. Рисунок 2 был создан с помощью BioRender.com.
Tissue Preparation | |||
Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
Laser/microscope | |||
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter – CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter – deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m |
|
DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser |
|
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 |
|
FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation |
|
SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ |
|
Lipid/Drug Imaging | |||
35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= |
|
Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true |
|
Data Analysis | |||
FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ |
|
Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ |
|
Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |