Tutarlı Raman Saçılma Görüntüleme Kullanarak Ciltteki Farmasötik Bileşiklerin Görselleştirilmesi ve Ölçülmesi
Summary
Cilt içindeki farmasötik bileşikleri görselleştirmek ve ölçmek için tutarlı bir Raman saçılma görüntüleme metodolojisi açıklanmaktadır. Bu yazıda deri dokusu hazırlığı (insan ve fare) ve topikal formülasyon uygulaması, uzaysal zamansal konsantrasyon profillerini ölçmek için görüntü elde etme ve topikal ilaç dağıtımını değerlendirmek için ön farmakokinetik analiz açıklanmaktadır.
Abstract
Topikal formülasyon uygulamasından sonra kutanöz farmakokinetiği (cPK), düzenleyici ve ilaç geliştirme bilim adamlarının topikal biyoyararlanımı (BA) mekanik olarak anlamaları için özel bir ilgi alanı olmuştur. Bant sıyırma, dermal mikrodiyaliz veya dermal açık akışlı mikroperfüzyon gibi yarı invaziv tekniklerin tümü makro ölçekli cPK’yi ölçer. Bu teknikler geniş cPK bilgisi sağlamış olsa da, topluluk aktif farmasötik bileşen (API) penetrasyonu ve hücresel düzeyde geçirgenlik konusunda mekanik bir anlayıştan yoksundur.
Mikro ölçekli cPK’yi ele almak için invaziv olmayan bir yaklaşım, dışsal etiketlere veya kimyasal modifikasyona gerek kalmadan içsel moleküler titreşimleri seçici olarak hedefleyen tutarlı Raman saçılma görüntülemesidir (CRI). CRI, API’lerin veya aktif olmayan bileşenlerin hassas ve seçici bir şekilde ölçülmesini sağlayan iki ana yönteme sahiptir – tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (CARS) ve uyarılmış Raman saçılması (SRS). CARS tipik olarak yapısal cilt bilgilerini türetmek veya kimyasal kontrastı görselleştirmek için kullanılır. Buna karşılık, moleküler konsantrasyonla doğrusal olan SRS sinyali, cilt tabakalaşmalarındaki API’leri veya aktif olmayan bileşenleri ölçmek için kullanılır.
CRI ile cPK için fare dokusu yaygın olarak kullanılmasına rağmen, topikal BA ve biyoeşdeğerlik (BE), düzenleyici onaydan önce insan dokusunda değerlendirilmelidir. Bu yazıda topikal BA ve BE’nin değerlendirilmesinde kantitatif farmakokinetik KRİ çalışmalarında kullanılacak ex vivo deri hazırlama ve görüntüleme metodolojisi sunulmaktadır. Bu metodoloji, zaman içinde insan ve fare derisinde güvenilir ve tekrarlanabilir API ölçümü sağlar. Lipid bakımından zengin ve lipid bakımından fakir bölmelerdeki konsantrasyonlar ve zaman içindeki toplam API konsantrasyonu ölçülür; bunlar mikro ve makro ölçekli BA ve potansiyel olarak BE tahminleri için kullanılır.
Introduction
Topikal ilaç ürünü uygulamasından sonra cPK’yi değerlendirmek için kullanılan metodolojiler, klasik in vitro permeasyon testi (IVPT) çalışmaları 1,2,3,4,5 ve bant sıyırma 6,7,8’den açık akışlı mikroperfüzyon veya dermal mikrodiyaliz 9,10,11 gibi ek metodolojilere genişlemiştir. 12,13,14. İlgilenilen hastalığa bağlı olarak potansiyel olarak çeşitli lokal terapötik etki bölgeleri vardır. Bu nedenle, bir API’nin amaçlanan yerel eylem alanına ulaşma oranını ve kapsamını değerlendirmek için karşılık gelen sayıda metodoloji olabilir. Yukarıda belirtilen metodolojilerin her birinin avantajları olsa da, en büyük dezavantaj mikro ölçekli cPK bilgisinin eksikliğidir (yani, API’nin nereye gittiğini ve nasıl yayıldığını görselleştirememe).
Topikal BA ve BE’yi tahmin etmek için ilgi çekici bir noninvaziv metodoloji, iki görüntüleme yöntemine ayrılabilen CRI’dır: CARS ve SRS mikroskopisi. Bu tutarlı Raman yöntemleri, doğrusal olmayan Raman etkileri yoluyla moleküllerin kimyasal olarak spesifik görüntülenmesini sağlar. CRI’da, iki lazer darbe treni bir numune içinde odaklanır ve taranır; lazer frekansları arasındaki enerji farkı, ilgilenilen kimyasal yapılara özgü titreşim modlarını hedeflemek üzere ayarlanmıştır. CRI süreçleri doğrusal olmadığından, sadece mikroskop odağında bir sinyal üretilir ve dokunun üç boyutlu farmakokinetik tomografik görüntülenmesine izin verir. cPK bağlamında, CARS, lipit bakımından zengin cilt yapılarının yeri gibi doku yapısal bilgilerini elde etmek için kullanılmıştır15. Buna karşılık, SRS, sinyali konsantrasyonla doğrusal olduğu için moleküler konsantrasyonu ölçmek için kullanılmıştır. Ex vivo cilt örnekleri için, CARS’ı epi-yön16’da ve SRS’yi şanzıman modu17’de gerçekleştirmek avantajlıdır. Bu nedenle, ince doku örnekleri SRS sinyalinin algılanmasına ve miktarının belirlenmesine izin verecektir.
Bir model doku olarak, çıplak fare kulağı, küçük dezavantajları olan çeşitli avantajlar sunar. Bir avantajı, dokunun zaten ~ 200-300 μm kalınlığında olması ve daha fazla numune hazırlığı gerektirmemesidir. Ek olarak, bir görüş alanına eksenel olarak odaklanarak çeşitli cilt tabakalaşmaları görülür (örneğin, stratum korneum, yağ bezleri (SG’ler), adipositler ve deri altı yağ)16,18. Bu, insan derisi örneklerine geçmeden önce kutanöz permeasyon yollarının ve topikal BA tahminlerinin klinik öncesi ön tahminine izin verir. Bununla birlikte, çıplak fare modeli, cilt yapısındaki farklılıklar nedeniyle in vivo senaryolara ekstrapolasyonda zorluk gibi sınırlamalar sunar19. Çıplak fare kulağı ön sonuçlar elde etmek için mükemmel bir model olsa da, insan derisi modeli altın standarttır. Donmuş insan derisinin in vivo geçirgenlik kinetiği 20,21,22’yi doğru bir şekilde özetlemeye uygunluğu ve uygulanabilirliği hakkında çeşitli yorumlar yapılmış olmasına rağmen, donmuş insan derisinin kullanımı in vitro API geçirgenlik kinetiğinin değerlendirilmesi için kabul edilmiş bir yöntemdir23,24,25 . Bu protokol, fare ve insan derisindeki çeşitli cilt katmanlarını görselleştirirken, lipit bakımından zengin ve lipit bakımından fakir yapılardaki API konsantrasyonlarını ölçer.
CRI, dokulardaki bileşikleri spesifik olarak görselleştirmek için çok sayıda alanda kullanılmış olsa da, topikal olarak uygulanan ilaç ürünlerinin cPK’sini araştıran sınırlı çabalar olmuştur. CRI kullanarak topikal ürünlerin topikal BA / BE’sini değerlendirmek için, önce doğru karşılaştırmalar yapmak için standartlaştırılmış bir protokole sahip olmak gerekir. Cilde ilaç dağıtımı için CRI kullanan önceki çabalar, veriler içinde değişkenlik göstermiştir. Bu nispeten yeni bir CRI uygulaması olduğundan, bir protokol oluşturmak güvenilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir 18,26,27. Bu yaklaşım, Raman spektrumunun biyolojik sessiz bölgesinde yalnızca belirli bir dalga sayısını hedefler. Ancak, çoğu API ve etkin olmayan bileşenlerin parmak izi bölgesinde Raman kaymaları vardır. Bu daha önce parmak izi bölgesindeki dokudan kaynaklanan doğal sinyal nedeniyle zorluklar yaratmıştı. Son lazer ve hesaplamalı gelişmeler, burada sunulan yaklaşımla birlikte de kullanılabilen bu engeli ortadan kaldırmıştır28. Burada sunulan bu yaklaşım, sessiz bölgede (2.000-2.300 cm-1) Raman kayması olan bir API’nin nicelleştirilmesine izin verir. Bu, ilacın fizyokimyasal özellikleri ile sınırlı değildir, bu da daha önce bahsedilen bazı cPK izleme metodolojileri için geçerli olabilir29.
Protokol, çeşitli preparatlar için cilt kalınlığındaki numuneden numuneye değişkenliği azaltmalıdır, çünkü kalın insan derisi örnekleri, kalın numune tarafından ışık saçılması nedeniyle ilaç ürünü uygulamasından sonra minimum sinyal üretecektir. Bu makalenin amacı, tekrarlanabilir görüntüleme standartlarını sağlayan bir doku hazırlama metodolojisi sunmaktır. Ek olarak, CRI sistemi, potansiyel hata kaynaklarını azaltmak ve sinyal-gürültü sinyalini en aza indirmek için açıklandığı gibi kurulur. Bununla birlikte, bu makale CRI mikroskobunun yol gösterici ilkelerini ve teknik değerlerini tartışmayacaktır, çünkü bu daha önce30 ele alınmıştır. Son olarak, bir deneyin başarısını veya başarısızlığını belirlemek için sonuçların yorumlanmasına izin vermek için kapsamlı veri analizi prosedürü araştırılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Topikal BA / BE’nin değerlendirilmesi, tek bir yöntemin in vivo cPK’yi tam olarak karakterize edemeyeceği için çok yönlü bir yaklaşım gerektiren bir araştırma alanıdır. Bu protokol, tutarlı Raman görüntülemesine dayanan topikal bir ilaç ürününün BA / BE’sinin değerlendirilmesi için bir metodoloji sunmaktadır. Göz ardı edilebilecek ilk noktalardan biri, özellikle kantitatif iletim SRS görüntüleme için cilt örneklerinin ne kadar ince olması gerektiğidir. Cilt çok kalınsa (y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Evans Grubu’ndan Dr. Fotis Iliopoulos ve Daniel Greenfield’a bu makaleyi tartışmaları ve düzeltmeleri için teşekkür eder. Buna ek olarak, yazarlar LEO Pharma’nın desteğini kabul etmek istiyor. Şekil 2 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Tissue Preparation | |||
| Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
| Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
| Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
| High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
| Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
| Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
| Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
| Laser/microscope | |||
| 650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter – CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
| Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
| D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter – deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m |
|
| DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser |
|
| Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
| Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 |
|
| FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
| Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
| Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
| ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation |
|
| SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
| SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
| UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ |
|
| Lipid/Drug Imaging | |||
| 35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
| Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
| Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= |
|
| Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true |
|
| Data Analysis | |||
| FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ |
|
| Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ |
|
| Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |
References
- Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J., Benson, H. E., Watkinson, A. C. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. , 85-108 (2012).
- Shin, S. H., et al. On the road to development of an in vitro permeation test (IVPT) model to compare heat effects on transdermal delivery systems: exploratory studies with nicotine and fentanyl. Pharmaceutical Research. 34 (9), 1817-1830 (2017).
- Hossain, A., et al. Preparation, characterisation, and topical delivery of terbinafine. Pharmaceutics. 11 (10), 548 (2019).
- Santos, L. L., Swofford, N. J., Santiago, B. G. In vitro permeation test (IVPT) for pharmacokinetic assessment of topical dermatological formulations. Current Protocols in Pharmacology. 91 (1), 79 (2020).
- Iliopoulos, F., Caspers, P. J., Puppels, G. J., Lane, M. E. Franz cell diffusion testing andquantitative confocal Raman spectroscopy: In vitro-in vivo correlation. Pharmaceutics. 12 (9), 887 (2020).
- Cordery, S., et al. Topical bioavailability of diclofenac from locally-acting, dermatological formulations. International Journal of Pharmaceutics. 529 (1-2), 55-64 (2017).
- Pensado, A., et al. Stratum corneum sampling to assess bioequivalence between topicalacyclovir products. Pharmaceutical Research. 36 (12), 1-16 (2019).
- Zhang, Y., et al. Dermal delivery of niacinamide-in vivo studies. Pharmaceutics. 13 (5), 726 (2021).
- Bodenlenz, M., et al. Open flow microperfusion as a dermal pharmacokinetic approach to evaluate topical bioequivalence. Clinical Pharmacokinetics. 56 (1), 91-98 (2017).
- Eirefelt, S., et al. Evaluating dermal pharmacokinetics and pharmacodymanic effect of soft topical PDE4 inhibitors:Open flow microperfusion and skin biopsies. Pharmaceutical Research. 37 (12), 1-12 (2020).
- Stagni, G., O’Donnell, D., Liu, Y. J., Kellogg, J. D. L., Shepherd, A. M. Iontophoretic current and intradermal microdialysis recovery in humans. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 49-54 (1999).
- Garcia Ortiz, P., Hansen, S. H., Shah, V. P., Menne, T., Benfeldt, E. Impact of adultatopic dermatitis on topical drug penetration: assessment by cutaneous microdialysis and tape stripping. Acta Dermato-Venereologica. 89 (1), 33-38 (2009).
- Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).
- Kuzma, B. A., et al. Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741 (2021).
- Begley, R., Harvey, A., Byer, R. L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy. Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).
- Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).
- Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
- Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning. Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).
- Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin. Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).
- Nielsen, J. B., Plasencia, I., Sørensen, J. A., Bagatolli, L. Storage conditions of skin affect tissue structure and subsequent in vitro percutaneous penetration. Skin Pharmacology and Physiology. 24 (2), 93-102 (2011).
- Barbero, A. M., Frasch, H. F. Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds. Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).
- Babu, R., et al. The influence of various methods of cold storage of skin on the permeation of melatonin and nimesulide. Journal of Controlled Release. 86 (1), 49-57 (2003).
- Skelly, J. P., et al. FDA and AAPS report of the workshop on principles and practices of in vitro percutaneous penetration studies: relevance to bioavailability and bioequivalence. Pharmaceutical Research. 4 (3), 265-267 (1987).
- OECD. Guidance document for the conduct of skin absorption studies. OECD. , (2004).
- OECD. Test no. 428: Skin absorption: In vitro method. OECD. , (2004).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
- Herkenne, C., et al. In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability. Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).
- Alfonso-Garcıa, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Osseiran, S., et al. Longitudinal monitoring of cancer cell subpopulations in monolayers, 3D spheroids, and xenografts using the photoconvertible dye DiR. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
- Evennett, P. Kohler illumination: a simple interpretation. Proceedings of the Royal Microscopical Society. 28 (4), 189-192 (1983).
- Sanderson, J. Fundamentals of microscopy. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (2), 76 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hunter, J. D. Matplotlib: A 2D graphics environment. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).
- Wickham, H. . ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , (2016).
- Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. Development of R packages:’Non-Compart’ and ‘ncar’ for noncompartmental analysis (NCA). Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).
