Настоящий протокол описывает уникальную, клинически значимую модель заболевания периферических артерий, которая сочетает электрокоагуляцию бедренной артерии и вен с введением ингибитора синтазы оксида азота для индуцирования гангрены задних конечностей у мышей FVB. Внутрисердечная перфузия DiI затем используется для трехмерной визуализации сосудов подножки с высоким разрешением.
Заболевание периферических артерий (PAD) является значительной причиной заболеваемости, возникающей в результате хронического воздействия атеросклеротических факторов риска. Пациенты, страдающие от его наиболее тяжелой формы, хронической угрожающей конечностям ишемии (ХМТ), сталкиваются с существенными нарушениями повседневной жизни, включая хроническую боль, ограниченное расстояние ходьбы без боли и незаживающие раны. Доклинические модели были разработаны на различных животных для изучения PAD, но ишемия задних конечностей мыши остается наиболее широко используемой. В этих моделях могут быть значительные различия в реакции на ишемическое оскорбление в зависимости от используемого штамма мыши, а также от места, количества и средств нарушения артериальной артерии. Этот протокол описывает уникальный метод, сочетающий электрокоагуляцию бедренной артерии и вен с введением ингибитора синтазы оксида азота (NOS) для надежного индуцирования гангрены подножки у мышей Friend Virus B (FVB), что напоминает потерю тканей CLTI. В то время как традиционные средства оценки реперфузии, такие как лазерная допплеровская перфузионная визуализация (LDPI), по-прежнему рекомендуются, внутрисердечная перфузия липофильного красителя 1,1′-диоктадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндокарбоцианинперхлорат (DiI) используется для маркировки сосудистой системы. Последующая конфокальная лазерная сканирующая микроскопия с высоким разрешением позволяет проводить трехмерную (3D) реконструкцию сосудистых сетей подножки, что дополняет традиционные средства оценки реперфузии в моделях ишемии задних конечностей.
Заболевание периферических артерий (PAD), характеризующееся снижением притока крови к конечностям из-за атеросклероза, поражает 6,5 миллиона человек в Соединенных Штатах и 200 миллионов человек во всем мире1. Пациенты с PAD испытывают снижение функции конечностей и качества жизни, а пациенты с CLTI, наиболее тяжелой формой PAD, подвергаются повышенному риску ампутации и смерти с 5-летней смертностью, приближающейся к 50%2. В клинической практике пациенты с голеностопно-плечевыми индексами (ABI) <0,9 считаются имеющими PAD, а пациенты с ABI <0,4, связанными либо с болью в покое, либо с потерей тканей, как имеющие CLTI3. Симптомы варьируются среди пациентов с аналогичными ИБИ в зависимости от повседневной активности, мышечной толерантности к ишемии, анатомических вариаций и различий в коллатеральном развитии4. Гангрена пальцев и конечностей является наиболее тяжелым проявлением всех сосудистых окклюзионных заболеваний, которые приводят к ХЛМ. Это форма сухого некроза, которая мумифицирует мягкие ткани. Помимо атеросклеротической PAD, она также может наблюдаться у больных сахарным диабетом, васкулитами, такими как болезнь Бюргера и феномен Рейно, или кальцифилаксией в условиях терминальной стадии почечной недостаточности5,6.
Было разработано несколько доклинических моделей для изучения патогенеза PAD/ CLTI и проверки эффективности потенциальных методов лечения, наиболее распространенным из которых остается ишемия задних конечностей мышей. Индуцирование ишемии задних конечностей у мышей обычно осуществляется путем обструкции кровотока из подвздошных или бедренных артерий, либо путем перевязки швов, электрокоагуляции или других средств сужения желаемого сосуда7. Эти методы резко уменьшают перфузию до задней конечности и стимулируют неоваскуляризацию в мышцах бедра и икр. Однако существуют существенные зависящие от штамма мышей различия в чувствительности к ишемическому инсульту, частично обусловленные анатомическими различиями в коллатеральном распределении8,9. Например, мыши C57BL/6 относительно устойчивы к ишемии задних конечностей, демонстрируя снижение функции конечностей, но, как правило, отсутствие признаков гангрены в подушечке ноги. С другой стороны, мыши BALB/c по своей природе имеют плохую способность восстанавливаться после ишемии и обычно развивают аутоампутацию стопы или голени только после перевязки бедренной артерии. Эта тяжелая реакция на ишемию сужает терапевтическое окно и может препятствовать продольной оценке реперфузии и функции конечностей. Интересно, что генетические различия в одном количественном локусе признака, расположенном на мышиной хромосоме 7, были вовлечены в эти дифференциальные восприимчивости мышей C57BL/6 и BALB/c к некрозу тканей и реперфузии конечностей10.
По сравнению со штаммами C57BL/6 и BALB/c, мыши FVB демонстрируют промежуточный, но непоследовательный ответ только на перевязку бедренной артерии. У некоторых животных развивается гангрена ног в виде черных ишемических ногтей или мумифицированных пальцев, а у других без каких-либо явных признаков ишемии11. Одновременное введение Nω-nitro-L-аргинина метилового эфира гидрохлорида (L-NAME), ингибитора синтазы оксида азота (NOS)12, предотвращает компенсаторные сосудорасширяющие механизмы и еще больше увеличивает окислительный стресс в ткани задних конечностей. В сочетании с перевязкой или коагуляцией бедренной артерии этот подход последовательно вызывает потерю ткани подножки у мышей FVB, которая напоминает атрофические изменения CLTI, но редко прогрессирует до аутоампутации конечностей11. Окислительный стресс является одной из отличительных черт PAD/CLTI и распространяется эндотелиальной дисфункцией и снижением биодоступности оксида азота (NO)13,14. NO представляет собой плюрипотентную молекулу, которая обычно оказывает благотворное влияние на артериальный и капиллярный кровоток, адгезию и агрегацию тромбоцитов, а также рекрутирование и активацию лейкоцитов13. Было также показано, что пониженные уровни NOS активируют ангиотензинпревращающий фермент, который индуцирует окислительный стресс и ускоряет прогрессирование атеросклероза15.
После того, как модель ишемии задних конечностей установлена, необходим мониторинг последующей реперфузии конечностей и терапевтического эффекта любых потенциальных методов лечения. В предложенной модели гангрены мышей степень потери тканей может быть сначала количественно определена с использованием оценки Фабера для оценки грубого внешнего вида стопы (0: нормальная, 1-5: потеря ногтей, где оценка представляет собой количество пораженных ногтей, 6-10: атрофия пальцев, где оценка представляет количество пораженных цифр, 11-12: частичная и полная атрофия стопы, соответственно)9. Количественные измерения перфузии задних конечностей затем обычно производятся с использованием LDPI, который опирается на доплеровские взаимодействия между лазерным светом и эритроцитами для указания перфузии на уровне пикселей в интересующей области (ROI)16. Хотя этот метод является количественным, неинвазивным и идеально подходит для повторных измерений, он не обеспечивает зернистую анатомическую детализацию сосудистой системы задних конечностей16. Другие методы визуализации, такие как микрокомпьютерная томография (микро-КТ), магнитно-резонансная ангиография (МРА) и рентгеновская микроангиография, оказываются либо дорогостоящими, требующими сложных инструментов, либо иным образом технически сложными16. В 2008 году Li et al. описали технику маркировки кровеносных сосудов в сетчатке липофильным карбоцианиновым красителем DiI17. DiI включается в эндотелиальные клетки и путем прямой диффузии окрашивает сосудистые мембранные структуры, такие как ангиогенные ростки и псевдоподальные процессы17,18. Благодаря его прямой доставке в эндотелиальные клетки и высокофлуоресцентной природе красителя, эта процедура обеспечивает интенсивную и длительную маркировку кровеносных сосудов. В 2012 году Boden et al. адаптировали технику перфузии DiI к модели ишемии задних конечностей мышей с помощью полной визуализации собранных мышц-аддукторов бедра после перевязки бедренной артерии19.
Текущий метод обеспечивает относительно недорогой и технически осуществимый способ оценки неоваскуляризации в ответ на ишемию заднего края и генную или клеточную терапию. В дальнейшей адаптации этот протокол описывает применение перфузии DiI для изображения сосудистой системы подножки в высоком разрешении и 3D в мышиной модели гангрены задних конечностей.
В то время как ишемия задних конечностей мышей является наиболее широко используемой доклинической моделью для изучения неоваскуляризации при PAD и CLTI, существуют значительные различия в тяжести и восстановлении ишемии в зависимости от конкретного используемого штамма мыши, а также м?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами Z-J L и OC V от Национальных институтов здравоохранения [R01HL149452 и VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Мы также благодарим Центр микроскопии и визуализации Проекта Майами по лечению паралича в Медицинской школе Университета Майами за предоставление доступа к их программному обеспечению для анализа и обработки изображений.
Binder clips (small) | Office supply store | ||
Buprenorphine (sustained-release) | |||
Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Ketamine | |||
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
Needles (27 G) | BD | 305109 | |
Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
Xylazine |