Трехмерная визуализация высокого разрешения сосудистой оболочки подножки в модели гангрены заднего скольжения
Summary
Настоящий протокол описывает уникальную, клинически значимую модель заболевания периферических артерий, которая сочетает электрокоагуляцию бедренной артерии и вен с введением ингибитора синтазы оксида азота для индуцирования гангрены задних конечностей у мышей FVB. Внутрисердечная перфузия DiI затем используется для трехмерной визуализации сосудов подножки с высоким разрешением.
Abstract
Заболевание периферических артерий (PAD) является значительной причиной заболеваемости, возникающей в результате хронического воздействия атеросклеротических факторов риска. Пациенты, страдающие от его наиболее тяжелой формы, хронической угрожающей конечностям ишемии (ХМТ), сталкиваются с существенными нарушениями повседневной жизни, включая хроническую боль, ограниченное расстояние ходьбы без боли и незаживающие раны. Доклинические модели были разработаны на различных животных для изучения PAD, но ишемия задних конечностей мыши остается наиболее широко используемой. В этих моделях могут быть значительные различия в реакции на ишемическое оскорбление в зависимости от используемого штамма мыши, а также от места, количества и средств нарушения артериальной артерии. Этот протокол описывает уникальный метод, сочетающий электрокоагуляцию бедренной артерии и вен с введением ингибитора синтазы оксида азота (NOS) для надежного индуцирования гангрены подножки у мышей Friend Virus B (FVB), что напоминает потерю тканей CLTI. В то время как традиционные средства оценки реперфузии, такие как лазерная допплеровская перфузионная визуализация (LDPI), по-прежнему рекомендуются, внутрисердечная перфузия липофильного красителя 1,1′-диоктадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндокарбоцианинперхлорат (DiI) используется для маркировки сосудистой системы. Последующая конфокальная лазерная сканирующая микроскопия с высоким разрешением позволяет проводить трехмерную (3D) реконструкцию сосудистых сетей подножки, что дополняет традиционные средства оценки реперфузии в моделях ишемии задних конечностей.
Introduction
Заболевание периферических артерий (PAD), характеризующееся снижением притока крови к конечностям из-за атеросклероза, поражает 6,5 миллиона человек в Соединенных Штатах и 200 миллионов человек во всем мире1. Пациенты с PAD испытывают снижение функции конечностей и качества жизни, а пациенты с CLTI, наиболее тяжелой формой PAD, подвергаются повышенному риску ампутации и смерти с 5-летней смертностью, приближающейся к 50%2. В клинической практике пациенты с голеностопно-плечевыми индексами (ABI) <0,9 считаются имеющими PAD, а пациенты с ABI <0,4, связанными либо с болью в покое, либо с потерей тканей, как имеющие CLTI3. Симптомы варьируются среди пациентов с аналогичными ИБИ в зависимости от повседневной активности, мышечной толерантности к ишемии, анатомических вариаций и различий в коллатеральном развитии4. Гангрена пальцев и конечностей является наиболее тяжелым проявлением всех сосудистых окклюзионных заболеваний, которые приводят к ХЛМ. Это форма сухого некроза, которая мумифицирует мягкие ткани. Помимо атеросклеротической PAD, она также может наблюдаться у больных сахарным диабетом, васкулитами, такими как болезнь Бюргера и феномен Рейно, или кальцифилаксией в условиях терминальной стадии почечной недостаточности5,6.
Было разработано несколько доклинических моделей для изучения патогенеза PAD/ CLTI и проверки эффективности потенциальных методов лечения, наиболее распространенным из которых остается ишемия задних конечностей мышей. Индуцирование ишемии задних конечностей у мышей обычно осуществляется путем обструкции кровотока из подвздошных или бедренных артерий, либо путем перевязки швов, электрокоагуляции или других средств сужения желаемого сосуда7. Эти методы резко уменьшают перфузию до задней конечности и стимулируют неоваскуляризацию в мышцах бедра и икр. Однако существуют существенные зависящие от штамма мышей различия в чувствительности к ишемическому инсульту, частично обусловленные анатомическими различиями в коллатеральном распределении8,9. Например, мыши C57BL/6 относительно устойчивы к ишемии задних конечностей, демонстрируя снижение функции конечностей, но, как правило, отсутствие признаков гангрены в подушечке ноги. С другой стороны, мыши BALB/c по своей природе имеют плохую способность восстанавливаться после ишемии и обычно развивают аутоампутацию стопы или голени только после перевязки бедренной артерии. Эта тяжелая реакция на ишемию сужает терапевтическое окно и может препятствовать продольной оценке реперфузии и функции конечностей. Интересно, что генетические различия в одном количественном локусе признака, расположенном на мышиной хромосоме 7, были вовлечены в эти дифференциальные восприимчивости мышей C57BL/6 и BALB/c к некрозу тканей и реперфузии конечностей10.
По сравнению со штаммами C57BL/6 и BALB/c, мыши FVB демонстрируют промежуточный, но непоследовательный ответ только на перевязку бедренной артерии. У некоторых животных развивается гангрена ног в виде черных ишемических ногтей или мумифицированных пальцев, а у других без каких-либо явных признаков ишемии11. Одновременное введение Nω-nitro-L-аргинина метилового эфира гидрохлорида (L-NAME), ингибитора синтазы оксида азота (NOS)12, предотвращает компенсаторные сосудорасширяющие механизмы и еще больше увеличивает окислительный стресс в ткани задних конечностей. В сочетании с перевязкой или коагуляцией бедренной артерии этот подход последовательно вызывает потерю ткани подножки у мышей FVB, которая напоминает атрофические изменения CLTI, но редко прогрессирует до аутоампутации конечностей11. Окислительный стресс является одной из отличительных черт PAD/CLTI и распространяется эндотелиальной дисфункцией и снижением биодоступности оксида азота (NO)13,14. NO представляет собой плюрипотентную молекулу, которая обычно оказывает благотворное влияние на артериальный и капиллярный кровоток, адгезию и агрегацию тромбоцитов, а также рекрутирование и активацию лейкоцитов13. Было также показано, что пониженные уровни NOS активируют ангиотензинпревращающий фермент, который индуцирует окислительный стресс и ускоряет прогрессирование атеросклероза15.
После того, как модель ишемии задних конечностей установлена, необходим мониторинг последующей реперфузии конечностей и терапевтического эффекта любых потенциальных методов лечения. В предложенной модели гангрены мышей степень потери тканей может быть сначала количественно определена с использованием оценки Фабера для оценки грубого внешнего вида стопы (0: нормальная, 1-5: потеря ногтей, где оценка представляет собой количество пораженных ногтей, 6-10: атрофия пальцев, где оценка представляет количество пораженных цифр, 11-12: частичная и полная атрофия стопы, соответственно)9. Количественные измерения перфузии задних конечностей затем обычно производятся с использованием LDPI, который опирается на доплеровские взаимодействия между лазерным светом и эритроцитами для указания перфузии на уровне пикселей в интересующей области (ROI)16. Хотя этот метод является количественным, неинвазивным и идеально подходит для повторных измерений, он не обеспечивает зернистую анатомическую детализацию сосудистой системы задних конечностей16. Другие методы визуализации, такие как микрокомпьютерная томография (микро-КТ), магнитно-резонансная ангиография (МРА) и рентгеновская микроангиография, оказываются либо дорогостоящими, требующими сложных инструментов, либо иным образом технически сложными16. В 2008 году Li et al. описали технику маркировки кровеносных сосудов в сетчатке липофильным карбоцианиновым красителем DiI17. DiI включается в эндотелиальные клетки и путем прямой диффузии окрашивает сосудистые мембранные структуры, такие как ангиогенные ростки и псевдоподальные процессы17,18. Благодаря его прямой доставке в эндотелиальные клетки и высокофлуоресцентной природе красителя, эта процедура обеспечивает интенсивную и длительную маркировку кровеносных сосудов. В 2012 году Boden et al. адаптировали технику перфузии DiI к модели ишемии задних конечностей мышей с помощью полной визуализации собранных мышц-аддукторов бедра после перевязки бедренной артерии19.
Текущий метод обеспечивает относительно недорогой и технически осуществимый способ оценки неоваскуляризации в ответ на ишемию заднего края и генную или клеточную терапию. В дальнейшей адаптации этот протокол описывает применение перфузии DiI для изображения сосудистой системы подножки в высоком разрешении и 3D в мышиной модели гангрены задних конечностей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как ишемия задних конечностей мышей является наиболее широко используемой доклинической моделью для изучения неоваскуляризации при PAD и CLTI, существуют значительные различия в тяжести и восстановлении ишемии в зависимости от конкретного используемого штамма мыши, а также м?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Z-J L и OC V от Национальных институтов здравоохранения [R01HL149452 и VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Мы также благодарим Центр микроскопии и визуализации Проекта Майами по лечению паралича в Медицинской школе Университета Майами за предоставление доступа к их программному обеспечению для анализа и обработки изображений.
Materials
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
Referências
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system – nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
