Spatiotemporale subcellulaire manipulatie van het microtubulecytoskelet in het levende pre-implantatiemuismyo met behulp van photostatinen

Summary

Typische microtubuleremmers, die veel worden gebruikt in fundamenteel en toegepast onderzoek, hebben verstrekkende effecten op cellen. Onlangs ontstonden fototatinen als een klasse van fotoschakelbare microtubuleremmers, in staat tot onmiddellijke, omkeerbare, spatiotemporaal nauwkeurige manipulatie van microtubuli. Dit stapsgewijze protocol beschrijft de toepassing van fototatinen in een 3D live pre-implantatiemuismyo.

Abstract

Het microtubule cytoskelet vormt het raamwerk van een cel en is fundamenteel voor intracellulair transport, celdeling en signaaltransductie. Traditionele farmacologische verstoring van het alomtegenwoordige microtubulinetwerk met behulp van bijvoorbeeld nocodazol kan verwoestende gevolgen hebben voor elke cel. Reversibel fotoschakelbare microtubuleremmers hebben het potentieel om de beperkingen te overwinnen door medicijneffecten op een spatiotemporaal gecontroleerde manier te implementeren. Een dergelijke familie van geneesmiddelen is de op azobenzeen gebaseerde fototatinen (PST’s). Deze verbindingen zijn inactief in donkere omstandigheden en bij verlichting met UV-licht binden ze zich aan de colchicine-bindingsplaats van β tubuline en blokkeren ze microtubule polymerisatie en dynamische omzet. Hier is de toepassing van PST’s in het 3-dimensionale (3D) levende pre-implantatiemuismyo bedoeld om het microtubulinetwerk op subcellulair niveau te verstoren. Dit protocol biedt instructies voor de experimentele opstelling, evenals lichtactiverings- en deactiveringsparameters voor PST’s met behulp van live-cell confocale microscopie. Dit zorgt voor reproduceerbaarheid en stelt anderen in staat om deze procedure toe te passen op hun onderzoeksvragen. Innovatieve fotoschakelaars zoals PST’s kunnen evolueren als krachtige hulpmiddelen om het begrip van het dynamische intracellulaire microtubulinetwerk te vergroten en het cytoskelet in realtime niet-invasief te manipuleren. Bovendien kunnen PST’s nuttig zijn in andere 3D-structuren zoals organoïden, blastoïden of embryo’s van andere soorten.

Introduction

De microtubule-architectuur varieert sterk tussen verschillende celtypen om verschillende functies te ondersteunen ^1,2. De dynamische aard van groei en krimp maakt een snelle aanpassing aan extra- en intracellulaire signalen mogelijk en om te reageren op de steeds veranderende behoeften van een cel. Daarom kan het worden beschouwd als de “morfologische vingerafdruk” die een sleutelrol speelt in de cellulaire identiteit.

Farmacologische targeting van het microtubule cytoskelet met behulp van kleine molecuulremmers heeft geleid tot een overvloed aan fundamentele ontdekkingen in ontwikkelingsbiologie, stamcelbiologie, kankerbiologie en neurobiologie 3,4,5,6,7. Deze aanpak, hoewel onmisbaar, brengt verschillende beperkingen met zich mee, zoals toxiciteit en off-target effecten. Een van de meest gebruikte microtubule-targeting middelen, nocodazol, is bijvoorbeeld een krachtig microtubule-depolymeriserend medicijn⁸. Kleine-molecuulremmers zoals nocodazol zijn echter actief vanaf het moment van toepassing en, gezien de essentiële aard van het microtubule cytoskelet voor veel kritieke cellulaire functies, kan wereldwijde depolymerisatie van microtubuli off-target effecten veroorzaken, die mogelijk ongeschikt zijn voor veel toepassingen. Bovendien is de behandeling met nocodazol onomkeerbaar, tenzij monsters vrij van het geneesmiddel worden gewassen, waardoor continue live beeldvorming en dus nauwkeurige tracking van individuele microtubulifilamenten wordt voorkomen.

De ontwikkeling van lichtgeactiveerde verbindingen begon met de creatie van foto-onopgeloste moleculen en heeft een nieuw tijdperk ingeluid in het richten en monitoren van de effecten van microtubuligroeiremming op een nauwkeurige en spatiotemporaal gecontroleerde manier. Een familie van reversibel fotoschakelbare geneesmiddelen, fototatinen (PST’s), werden ontwikkeld door de stilbeencomponent van combretastatine A-4 te vervangen door azobenzeen⁹. PST’s zijn inactief tot verlichting met UV-licht, waarbij de inactieve transconfiguratie wordt omgezet in de actieve cis-configuratie door omkeerbare isomerisatie. Cis-PST’s remmen de polymerisatie van microtubuli door zich te binden aan de colchicine-bindingsplaats van β-tubuline, waardoor de interface met β-tubuline wordt geblokkeerd en dimerisatie wordt voorkomen die nodig is voor de groei van microtubuli¹⁰. Onder een cohort van PST’s is PST-1P naar voren gekomen als een loodverbinding omdat het de hoogste potentie heeft, volledig in water oplosbaar is en een snel begin van bioactiviteit vertoont na verlichting.

De meest effectieve trans– naar cis-isomerisatie van PST’s vindt plaats op golflengten tussen 360-420 nm, wat dubbele opties voor PST-activering mogelijk maakt. Een 405 nm laserlijn op een typische confocale microscoop kan worden toegediend voor een optimale ruimtelijke targeting van microtubuligroeiremming. De mogelijkheid om de locatie en timing van PST-activering te lokaliseren door middel van 405 nm laserverlichting vergemakkelijkt nauwkeurige temporele en ruimtelijke controle, waardoor verstoring van de microtubuledynamica op subcellulair niveau mogelijk is, binnen subseconde respons maal⁹. Als alternatief zorgt een betaalbaar LED UV-licht ervoor dat de verlichting van het hele organisme de microtubule-architectuur in het hele organisme verstoort. Dit kan een kosteneffectief alternatief zijn voor onderzoekers voor wie het nauwkeurig getimede begin van remming, in plaats van ruimtelijke targeting, het doel is. Een ander kenmerk van PST’s is hun on-demand inactivatie door groen licht toe te passen van een golflengte in het bereik van 510-540 nm⁹. Dit maakt het traceren van microtubule filamenten voor, tijdens en na PST-gemedieerde groeiremming mogelijk.

PST’s, hoewel nog steeds een relatief recent ontwerp, zijn gebruikt in tal van in vitro toepassingen op verschillende onderzoeksgebieden¹¹, waaronder onderzoek naar nieuwe mechanismen van celmigratie in amoeboïden¹², in neuronen geïsoleerd uit de hersenen van de pasgeboren muis¹³, en vleugelepitheelontwikkeling in Drosophila melanogaster¹⁴ . Andere lichtreactieve geneesmiddelen hebben bewezen waardevolle hulpmiddelen te zijn bij gerichte verstoring van de cellulaire functie. Een analoog van blebbistatine, azidoblebbistatine, werd bijvoorbeeld gebruikt voor verbeterde myosineremming onder verlichting^15,16. Dit benadrukt het potentieel voor nieuwe ontdekkingen als gevolg van het vermogen tot spatiotemporaal gecontroleerde remming van de cellulaire functie.

Levende 3D-organismen presenteren prachtige maar delicatere systemen om microtubulidynamica te manipuleren op een heel dier,eencellig of subcellulair niveau onder fysiologische omstandigheden. Met name het pre-implantatie muizenembryo biedt uitzonderlijk inzicht in de innerlijke werking van de cel en intercellulaire relaties binnen een organisme¹⁷. Temporeel en ruimtelijk gerichte opeenvolgende cycli van activering en deactivering van PST’s droegen bij aan de karakterisering van de interfasebrug, een post-cytokinetische structuur tussen cellen, als een niet-centrosomaal microtubuliorganiserend centrum in het pre-implantatiemuismyo¹⁶. Een vergelijkbare experimentele opstelling toonde de betrokkenheid van groeiende microtubuli bij de afdichting van het muizenembryo om blastocystvorming¹⁸ mogelijk te maken. Bovendien werden PST’s ook gebruikt in hele zebravisembryo’s om neuronale celmigratie te onderzoeken door de groei van microtubuli in een subset van cellen in de achterhersenen^{te remmen 19}.

Dit protocol beschrijft de experimentele opstelling en het gebruik van PST-1P in het pre-implantatiemuismyo. De instructies die hier worden gepresenteerd, kunnen ook de toepassing van PST’s begeleiden voor een breed scala aan doelstellingen, zoals het bestuderen van chromosoomsegregatie en celdeling, handel in intracellulaire lading en celmorfogenese en migratie. Bovendien zullen dergelijke studies de implementatie van PST’s in organoïde systemen, blastoïden en andere embryomodellen zoals Caenorhabditis elegans pt Xenopus laevis helpen, evenals mogelijk het gebruik van PST’s voor in-vitrofertilisatietechnologieën uitbreiden.

Protocol

Experimenten werden goedgekeurd door de Monash Animal Ethics Committee onder dierethiek nummer 19143. Dieren werden gehuisvest in specifieke pathogeenvrije dierhuisomstandigheden in de dierenfaciliteit (Monash Animal Research Platform) in strikte overeenstemming met ethische richtlijnen. 1. Pre-implantatie muizenembryoverzameling Superovuleren en paren muizen zoals eerder beschreven 16,18, in overeenstemming …

Representative Results

In overeenstemming met het protocol werden pre-implantatiemuismyo’s micro-geïnjecteerd met cRNA voor EB3, gelabeld met rood fluorescerend dTomato (EB3-dTomato). Dit maakt de visualisatie van groeiende microtubuli mogelijk terwijl EB3 zich bindt aan polymeriserende microtubuli plus uiteinden24. De experimenten werden 3 dagen na de bevruchting (E3) uitgevoerd wanneer het muizenembryo uit 16 cellen bestaat. Elke andere pre-implantatie ontwikkelingsstadium kan worden gebru…

Discussion

Het microtubulinetwerk is een integraal onderdeel van de fundamentele innerlijke werking van een cel. Bijgevolg biedt dit uitdagingen bij het manipuleren van microtubulidynamica in levende organismen, omdat elke verstoring van het netwerk de neiging heeft wijdverspreide gevolgen te hebben voor alle aspecten van de cellulaire functie. De opkomst van fotoschakelbare microtubule-targeting verbindingen biedt een manier om het cytoskelet nauwkeurig te manipuleren op een subcellulair niveau, met superieure controle voor de ind…

Materials

Aspirator tube	Sigma-Aldrich	A5177	For mouth aspiration apparatus
Chamber slides – LabTek	Thermo Fisher Scientific	NUN155411
cRNA encoding for EB3-dTomato	N/A	N/A	Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit
Culture dishes – 35mm	Thermo Fisher Scientific	150560
Human chorionic growth hormone	Sigma-Aldrich	C8554
Human Tubal Fluid (HTF) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B071
Imaris Image Analysis Software	Bitplane
Immersion Oil W 2010	Carl Zeiss	444969-0000-000	For use with microscope immersion objective
LED torch – Red light	Celestron	93588
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Mice – wild-type FVB/N, males and females	N/A	N/A	Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.
Microcapillary Pipettes – Kimble	Sigma-Aldrich	Z543306	For mouth aspiration apparatus
Microinjection buffer	N/A	N/A	5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
Mineral oil	Origio	ART-4008-5P
mMessage In vitro Transcription kit	Thermo Fisher Scientific	AM1340
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B074
Pregnant mare serum gonadotrophin	Prospec Bio	HOR-272
PST-1P	N/A	N/A	Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA purification kit	Sangon	B511361-0100
Ultrapure water	Sigma-Aldrich	W1503
ZEN Black Software	Carl Zeiss