Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.
Erken Drosophila embriyoları, çok çeşitli geleneksel ve embriyoya özgü organeller içeren büyük hücrelerdir. Embriyogenezin ilk üç saati boyunca, bu organeller aktin bazlı sitoplazmik akış ve mikrotübüller boyunca motor kaynaklı kaçakçılık ile güçlendirilmiş dramatik hareketlere maruz kalırlar. Çok sayıda küçük, organele özgü floresan probun (FP) geliştirilmesi, herhangi bir genotipte çok çeşitli farklı lipit içeren yapıların görselleştirilmesini mümkün kılar ve genetik olarak kodlanmış bir florofor gerektirmeden canlı görüntülemeye izin verir. Bu protokol, canlı görüntüleme yoluyla belirli organellerin kaçakçılığını izlemek için hayati boyaların ve moleküler probların Drosophila embriyolarına nasıl enjekte edileceğini göstermektedir. Bu yaklaşım, lipit damlacıklarının (LD’ler) etiketlenmesi ve partikül görüntü velosimetrisi (PIV) ile toplu hareketlerinin takip edilmesiyle gösterilmiştir. Bu protokol, lizozomlar, mitokondri, yumurta sarısı vezikülleri ve ER dahil olmak üzere diğer organellerin incelenmesine ve bireysel LD’lerin mikrotübüller boyunca hareketinin izlenmesine uygun bir strateji sağlar. Ticari olarak temin edilebilen boyaların kullanılması, spektrumun mor / mavi ve uzak kırmızı bölgelerine ayırmanın faydalarını getirir. Organellerin ve / veya sitoiskelet elementlerinin mikroenjeksiyon yoluyla multipleks birlikte etiketlenmesiyle, Drosophila’daki tüm genetik kaynaklar, floresan etiketli proteinlerin tanıtılmasına gerek kalmadan kaçakçılık çalışmaları için kullanılabilir. Düşük kuantum verimine ve kolayca ağartıcıya sahip genetik olarak kodlanmış floroforların aksine, mevcut boyaların çoğu, yüksek foton verimine sahip birkaç kanalın hızlı ve eşzamanlı olarak yakalanmasına izin verir.
Hayati boyalar ve moleküler problar, belirli hücresel yapıları ve organelleri canlı olarak görüntülemek için güçlü araçlardır. Drosophila embriyosunda, birçok farklı organel sitoiskelet güdümlü lokalizasyon 1,2,3,4 gösterir, ancak bu küçük moleküllerin uygulanması zordur, çünkü yumurta kabuğu birçoğu için geçirimsizdir. Bu protokol, organellerin büyük ölçekli kaçakçılığını tespit etmek için mikroenjeksiyon yoluyla canlı embriyolarda floresan probların (FP’ler) kullanılması için bir yöntem açıklamaktadır. Prosedür, enjeksiyon çözeltisinin hazırlanmasını, yumurta toplanmasını ve embriyoların hazırlanmasını, mikroenjeksiyonu, görüntülemeyi ve görüntü analizini kapsar.
Organellerin dramatik mekansal yeniden düzenlenmesi, kısmen bu hücrelerin büyüklüğü nedeniyle birçok hayvan oositinde, yumurtada ve embriyoda yaygındır. Örneğin, Drosophila embriyosunda, lipit damlacıkları (LD’ler) ve yumurta sarısı vezikülleri, hücreselleşmeden hemen önce embriyo merkezine doğru hareket eder5. Bu hareket mikrotübüllere bağlıdır ve iki organelden tükenmiş embriyonun çevresinin her yerinde ~ 40 μm’lik bir bölge bırakır. Daha erken bölünme aşamalarında, birçok organel, embriyo yüzeyinde aktin-miyozin bazlı kasılmalar tarafından tahrik edilen sitoplazmik akışlarla taşınır6. Birçok türün embriyoları benzer yeniden düzenlemeler sergilese de, Drosophila embriyosu görüntüleme yoluyla bu süreçleri takip etmek için özellikle uygundur, çünkü standart laboratuvar ‘oda sıcaklığında’ harici olarak gelişir, nispeten şeffaftır, çoğu mikroskop kurulumuna sığacak kadar küçüktür ve güçlü genetik araçlar kullanılarak manipüle edilebilir.
Bazı organeller için, bu yapıları özel olarak etiketleyen floresan etiketli proteinler mevcuttur. Örneğin, LSD-2 (dPLIN2 olarak da bilinir), embriyolarda özellikle LDs7’yi hedef alan bir proteindir. Yeşil Floresan Protein (GFP) ve LSD-28 arasında bir füzyonu kodlayan indüklenebilir transgenleri veya endojen LSD-2 geninin kodlama bölgesine sarı floresan proteinin (YFP) yerleştirildiği bir gen tuzağını taşıyan sinek hatları mevcuttur 9,10. Bununla birlikte, bu yaklaşımın, bu füzyon proteinlerinin düşük kuantum verimine sahip olması ve kolayca ağartma eğiliminde olması da dahil olmak üzere sınırlamaları vardır. Ek olarak, aynı anda birden fazla farklı yapının etiketlenmesi zor olabilir: birçok organel için, şu anda yalnızca bir tür floresan etiketi (genellikle GFP veya mCherry) mevcuttur, bu nedenle iki organelin aynı anda görüntülenmesi yeni transgenler veya eklemeler gerektirebilir; Ayrıca, uyumlu etiketler mevcut olsa bile, bunları tek bir suşa sokmak zaman alıcı haçlar gerektirebilir. Aynı zamanda, birçok güçlü genetik kaynağın kullanılmasını daha az kullanışlı hale getirir, örneğin, iki organel belirteç, bir Gal4 sürücüsü ve indüklenebilir bir RNAi yapısının hepsinin aynı annede bulunması gerekiyorsa.
Prensip olarak, bu sınırlamalar, hayati boyalar (örneğin, lizozomları işaretlemek için LysoTracker), moleküler problar (örneğin, mikrotübülleri etiketlemek için SiR-tübülin) ve floresan olarak etiketlenmiş biyolojik moleküller (örneğin, yağ asidi metabolizmasını araştırmak için C12 BODIPY11) dahil olmak üzere FP’lerin kullanımıyla aşılabilir. Kültürlü hücrelerde kullanımdan, tipik olarak hücresel biyolojiyi araştırmak için güçlü araçlar olarak iyi doğrulanırlar. FP’ler çok yönlüdür, üstün fotoğraf özelliklerine sahiptir ve floresan proteinlerle uyumludur. Birden fazla boya aynı anda karıştırılabilir ve uygulanabilir, genellikle spektrumun mor / mavi ve uzak kırmızı alanlarına ayırmanın faydaları ve küçük Stokes kaymaları, kanalın kanamasını önler. Küçük Stokes vardiyaları, birden fazla görüntüleme kanalının aynı anda yakalanmasını sağlayarak aynı anda birkaç organelin izlenmesini sağlar. Son olarak, diğer Drosophila türlerinin embriyolarındaki organelleri etiketlemek için eşit derecede uygulanabilirler, hatta floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin bulunmadığı diğer böcekler.
Bununla birlikte, bu FP’lerin çoğu, Drosophila embriyosunun ayrıntılı yumurta kabuğunu geçemez. Beş katmandan oluşur: mekanik hasarı önleyen üç dış koryonik katman (koryon) artı vitelin membranı çevreleyen ve kimyasal bir bariyer oluşturan mumsu bir tabaka12. Basitlik için, mumsu tabaka ve vitelin membranın kombinasyonu aşağıdaki “vitelin membran” olarak anılacaktır. Yumurta kabuğunu atlamak için, bu protokol FP’leri Drosophila embriyosuna sokmak için yerleşik bir embriyo mikroenjeksiyon yaklaşımını uyarlar. Protokol, bölünme evresi embriyolarında LD’lerin sitoplazmik akışının nasıl izleneceğini açıklar. Enjeksiyon iğnelerinin ve yumurta toplama kafeslerinin hazırlanmasını, yumurta toplama işlemini ve koryonun mekanik olarak çıkarılmasını içerir. Embriyoların nasıl mikroenjekte edileceğini ve görüntüleneceğini ve parçacık görüntü velosimetrisini kullanarak LD’lerin toplu akışının nasıl analiz edileceğini ele alır (PIV,6’dan uyarlanmıştır). Embriyonun hayatta kalmasını sağlamak ve görüntüleme için en iyi sistemi oluşturmak için sorun giderme konusunda tavsiyelerde bulunur. Ayrıca, protokolün LD’leri ve mikrotübülleri aynı anda görüntülemek veya lizozomlar, mitokondri, yumurta sarısı vezikülleri ve endoplazmik retikulum (ER) dahil olmak üzere diğer organellerin çalışmasına uygulamak için nasıl değiştirilebileceği de tartışılmaktadır.
Drosophila embriyosu, hücresel ve organizma biyolojisindeki temel soruları incelemek için güçlü ve kullanışlı bir modeldir. Göreceli basitliği, güçlü genetiği ve küçük boyutu, onu hem hücresel süreçleri hem de gelişimi görüntülemek için mükemmel bir sistem haline getirir. Burada, embriyolarda FP kullanımını sağlamak için standart bir mikroenjeksiyon protokolü uyarlanmıştır. Bu yaklaşım, genetik olarak kodlanmış floroforlara ihtiyaç duymadan spesifik hücresel yapıların floresan görüntülenmesine izin verir ve görüntülemeye birçok genetik arka plan açar. Birden fazla boyanın yanı sıra stratejik olarak seçilmiş floresan etiketli proteinlerin birleştirilmesi, görünür ışığın tüm spektrumunu kapsayan çok kanallı canlı görüntülemeyi açabilir.
Protokoldeki kritik adımlar:
Bu protokol, LD’leri etiketlemek için BODIPY 493/503 kullanır. Bu yaklaşım, diğer hücresel yapıları işaretlemek için kolayca uyarlanabilir. Sonraki görüntü analizi için en önemli faktörlerden biri, sinyal-gürültü oranı, yani boyanın arka plan sinyaline kıyasla parlaklığıdır. Lizozomlar (LysoTracker Red, 1 mM), ayrıca mitokondri (Mitoview 633, 200 μM), ER (ER izleyici Yeşil, 10 μM) ve mikrotübüller (SiR tübülini, DMSO’da 200 nM), Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5’te gösterildiği gibi başarıyla görüntülenmiştir. Ek olarak, yumurta sarısı vezikülleri otofloresandır ve UV uyarımı üzerine mavi ışık yayar (uyarma dalga boyu olarak 405 nm kullanan görüntü (Şekil 6)). Diğer boyalar için, boya konsantrasyonunun, kültürlenmiş hücrelerin canlı boyanması için gerekli olanın 100-1000 katı olmasını hedefleyin; bu, hücre kültürü ortamına seyreltilecek bir stok çözeltisinin konsantrasyonuna benzer. Bu protokol 100 fL’lik bir enjeksiyon gerektirdiğinden ve Drosophila embriyosu hacim18’de kabaca 9 nL olduğundan, bu boya konsantrasyonları, hücre kültürü ortamında bulunanın 1 / 100’ünün altındaki bir iç embriyonik konsantrasyona ortalamaya ulaşacaktır. Geçici olarak, lokal konsantrasyon enjeksiyon bölgesinde daha yüksek olacaktır, bu da iyi yayılmayan FP’ler (yani, mitokondriyal boyalar ve SiR-tübülin) için en uygun olanıdır. Bu FP’ler için, önerilen yüksek konsantrasyonlardan başlayın; Beklenmeyen bir ölüm gözlenirse, hayatta kalma ve sinyal gücü arasında kabul edilebilir bir uzlaşmaya varılana kadar art arda iki kat seyreltin.
Birden fazla boyayı birlikte enjekte ederken, her iki boya da aynı çözücüde olmalı veya hem çözücüler hem de boyalar karışımla uyumlu olmalıdır (~% 10’u aşan alkol konsantrasyonları önerilmez).
İğnelerin kalitesi, bu prosedürün başarısı için esastır, çünkü ucun mümkün olduğunca ince olması gerekir. Aksi takdirde, enjeksiyon yarasından kaynaklanan hasar, embriyonun sonraki gelişimini tehlikeye atabilir. Ticari iğne çektiriciler farklı olduğundan, üreticinin önerilerini takip etmek ve istenen şekle ulaşana kadar birden fazla çekme parametresini denemek önemlidir. Çatlak, pürüzlü veya büyük delikli bir iğne ucu ile çalışmak başarılı enjeksiyonu daha zor veya hatta imkansız hale getireceğinden, kalite kontrol adımı 1.1.3’ü gerçekleştirmek çok önemlidir.
Embriyonun kısmen kurutulması gerekir, böylece enjeksiyon sırasında ek hacimlerde sıvı eklenebilir. Embriyo az kurutulmuşsa, iğne kolayca girmeyecek ve iğne nüfuz ettikçe veya çözelti enjekte edildikçe sitoplazma fışkıracaktır. Embriyo aşırı kurutulmuşsa, sönük görünecek ve düzgün gelişmeyecektir. Tam kuruma süresi, hava nemi gibi yerel koşullara bağlıdır ve günden güne değişebilir. Her seans için ampirik olarak belirlenmelidir.
Embriyonun mikroenjeksiyondan sonra hayatta kalma kabiliyeti, iğnenin kalitesine, uygun kurumaya ve enjeksiyon hacminin 1 pL’den (ideal olarak 100 fL) daha azına sınırlandırılmasına kritik olarak bağlıdır. Bu parametreler optimize edildiği sürece, tarif edilen boyalar önerilen konsantrasyonlarda enjekte edildiğinde önemli bir toksisite görülmez. Embriyolar kuruma ve enjeksiyon adımlarında hayatta kalırlarsa, tipik olarak mikrop bandı uzantısına başarılı bir şekilde gelişirler, bunun bir istisnası, yüksek seviyelerde selülariizasyon kusurlarına neden olan mikrotübül ve ER problarıdır (her birinin stok konsantrasyonunun 100 fL enjeksiyonu). Test, DMSO, su ve ikisinin karışımları önerilen hacimlerde enjekte edildiğinde, ~% 75 veya daha fazla germ-bant uzantısı yoluyla embriyo hayatta kalma oranı ile belirgin bir gelişimsel kusur bulamamıştır. 1 pL’den fazla enjeksiyon hacimleri kusurlara neden oldu ve embriyolar 1 saatten az bir süre için geliştirilen ~ 4 pL hacimleriyle enjekte edildi. Bu nedenle, enjeksiyon hacimlerinin düşük tutulması gerekir, bu da boya konsantrasyonlarının yüksek olması gerektiği anlamına gelir.
Genel olarak, embriyonun yanal kenarı boyunca enjeksiyonlar, en az hasarla sonuçlandığı için tavsiye edilir. Bununla birlikte, enjeksiyon bölgesinin, kullanılan FP’lerin difüzyon özelliklerine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. BODIPY 493/503 ve LysoTracker, tüm embriyo boyunca Lipid Spot 610’dan (LD’leri işaretlemek için başka bir boya) daha hızlı yayılırken, SiR-Tubulin ve Mitoview 633 embriyo boyunca asla tam olarak yayılmaz (enjeksiyon sonrası 7 saate kadar görüntüleme). Bu nedenle, ilgilenilen bölgeye veya yakınına enjeksiyon gerekli olabilir. Ön veya arka bölgelere enjekte edilirken, özellikle ince bir iğne önerilir.
Görüntü elde etme, küçük organelleri ve tüm sitoiskelet bileşenlerini optik olarak kesitlemek ve çözmek için konfokal mikroskopiye dayanır. Birçok görüntünün (örneğin, STORM veya PALM) analizini gerektiren teknikler işe yaramaz, çünkü embriyonik içerikler hareket halindedir ve floroforlar fotoşalter için optimize edilmemiştir. Epifloresan mikroskopi, çoğu organeli ve daha küçük hücresel yapıları ortaya çıkarmak için yanal ve eksenel çözünürlükten yoksundur. Bu nedenlerden dolayı, konfokal mikroskop kullanılması veya ışık tabakası teknolojisinin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
Görüntü analizinin tekrarlanabilirliği büyük ölçüde tutarlı görüntüleme verilerine dayanır. En yüksek başarı şansı için, enjeksiyon tekniğinin optimizasyonu ve görüntü elde edilmesi gerekir. İlgilenilen boyaların (boyaların), enjeksiyon yerinin, embriyonun yaşının, enjeksiyon hacminin ve edinme kurulumunun tutarlı olduğu bir tekniğin oluşturulması ve uygulanması, görüntü analizi için en sağlam verileri üretecektir.
Yöntemin değiştirilmesi ve sorun giderme
Bu protokol, parçacık görüntü velosimetrisi kullanarak bölünme aşaması embriyolarındaki LD’lerin toplu akışını analiz etmek için bir yöntem göstermektedir. Aynı yaklaşım diğer organeller, diğer gelişim aşamaları ve diğer analiz yöntemleri için de kullanılabilir. Örneğin, Şekil 2 , embriyogenezin sinsityal aşamalarında akan LD’lerin ve asidik organellerin analizini, BODIPY 493/503 ve LysoTracker Red’in birlikte enjekte edilmesiyle görselleştirilmiştir. Döllenme sonrası 7 saate kadar embriyolarda LD hareketinin daha başarılı bir şekilde görüntülenmesi sağlanmıştır; Bu embriyolar enjeksiyon yarasını korur, ancak birkaç saat boyunca gelişebilir.
Bu protokol kullanılarak toplanan veriler parçacık görüntü velosimetrisi için kullanılmıştır, ancak başka birçok analiz tekniği mevcuttur. Örneğin, ImageJ, Imaris veya manuel izlemede bulunanlar gibi parçacık izleme programları, hareketli yapıların hızlarını ve yönselliklerini elde etmek için kullanılabilir. Bu tür izleme yazılımlarının çoğunun, düzlemsel hücre kültürü sistemlerinden gelen verilerle çalışmak üzere oluşturulduğunu ve Drosophila embriyosu gibi 3D yapılara her zaman iyi uyum sağlamadığını unutmayın. Ayrıca, en kaliteli parçacık izleme verilerinin oluşturulması için, birden fazla Z düzleminin görüntülenmesi gerekir; görüntü yığını edinme süreleri ~2 s’nin altındaysa bu mümkün olmalıdır. Bu kıyaslama, dönen disk konfokal, kafes ışık tabakası ve son lazer tarama konfokal sistemlerinde erişilebilir olmalıdır. Bununla birlikte, LD’ler, mitokondri ve lizozomlar gibi bol miktarda organel için parçacık izlemenin fizibilitesi, bir görüş alanındaki pozitif sinyal miktarı mevcut izleme yöntemleri için çok yüksek olduğu için düşüktür. Çekirdekler veya yumurta sarısı vezikülleri gibi daha az miktarda bulunan yapıların izlenmesi mümkün olabilir. Akış analizi için PIV, bölünme aşamalarındaki LD’ler ve asidik organeller için iyi çalışır, çünkü her iki organel de serbestçe hareket eder. Çekirdekler, ER ve mitokondri gibi organeller diğer hücresel yapılara bağlıdır ve bu nedenle serbestçe hareket etmezler ve serbest hareketi varsayan yazılım analizine uygun değildirler. Araştırmacı, ilgilendiği organele en uygun teknikleri seçmelidir.
Sinsityal ve hücresel blastoderm aşamaları sırasında, LD’ler (ve diğer bazı organeller) radyal olarak yönlendirilmiş mikrotübüller boyunca hareket eder5. Bu nedenle, tek mikrotübüllerin uzun mesafeler için odakta olduğu ve 2B’de parçacık izlemesine izin veren kesitsel görünümler ( Şekil 5’te olduğu gibi) bulmak mümkündür. Bu optik düzlemler embriyonun derinliklerinde olduğundan, genel sinyal gücü azalır ve sinyal-gürültü oranı azalır.
İzleme analizi için, mümkün olduğunca hızlı görüntüleme, hareketin ve dolayısıyla hareketli makinelerin önemli ayrıntılarını ortaya çıkarabilir. Örneğin, lipit-damlacık hareketi iki hareketli durumun bir karışımıdır: yavaş-kısa hareket (~200 nm / s; ortalama seyahat mesafesi ~ 100 nm) ve hızlı-uzun hareket (~ 450 nm / s; ortalama seyahat mesafesi ~ 1.000 nm)19; Böylece, görüntüler her saniye veya daha az sıklıkta çekilirse, yavaş-kısa durum tespit edilemez hale gelir. Bununla birlikte, sık görüntüleme aynı zamanda florofor beyazlatma ve fototoksisiteyi de indükler. Bu nedenle, görüntüleme koşulları, ele alınacak kesin soruya bağlı olarak ayarlanmalıdır.
Yöntemin sınırlamaları
İstenilen boyaya bağlı olarak, yöntem, boya çözünürlüğü ile enjeksiyon çözeltisinin toksisitesi arasındaki uyumluluk ile sınırlandırılabilir. İzopropanol ve etanol gibi alkollerin, düşük viskoziteleri nedeniyle bir iğne içinde işlenmesi zordur ve hücresel bileşenlere zarar verir ve embriyoyu öldürür.
Yöntem aynı zamanda embriyogenezdeki en erken adımları görselleştirmek için de uygun değildir, çünkü embriyoları enjeksiyona hazırlamak 30+ dakika sürer. Oda sıcaklığında, embriyonun ilk hücre döngüleri her biri sadece ~ 10 dakika uzunluğundadır; Bu nedenle, 5.2.3 adımında yeni döllenmiş bir yumurta seçilse bile, embriyo görüntülemeye hazır olduğunda ilk birkaç hücre döngüsü zaten tamamlanmış olacaktır.
UV / mavi aralığındaki ışıkla aydınlatma, daha uzun dalga boylarına göre çok daha fototoksiktir. Bu koşullar altında (örneğin, otofloresan yumurta sarısı veziküllerini takip etmek için; Şekil 6), görüntüleme süresini sınırlamak (daha kısa zaman serilerine yol açar) veya daha düşük lazer gücü kullanmak (sinyal-gürültü oranının azalmasıyla sonuçlanır) gerekir.
Hücreselcileştirmeden sonra, belirli bir yere enjekte edilen boyalar, birçok hücre zarından geçmeleri gerektiğinden, zayıf bir şekilde yayılma eğilimindedir. Bu, daha sonraki gelişim aşamalarında gözlem bölgesini sınırlar.
Yöntemin mevcut/alternatif yöntemler açısından önemi
LD’lerin ve diğer lipit içeren organellerin erken embriyolardaki hareketi, genetik olarak kodlanmış floroforlar, etiketsiz teknikler ve FP’lerin tanıtılmasıyla görselleştirilebilir. İkincisi, vitelin membran12’nin geçirgenleştirilmesi veya burada tartışılan mikroenjeksiyon yaklaşımı ile elde edilebilir.
Genetik olarak kodlanmış floroforlar, seviyeleri tipik olarak embriyodan embriyoya yüksek oranda tekrarlanabilen çok yönlü belirteçlerdir. Bununla birlikte, FP’lerden daha düşük kuantum verimlerine ve ağartıcılara sahiptirler. Tipik olarak, yalnızca bir veya iki etiketli versiyonda (örneğin, GFP veya mCherry) bulunurlar ve hangi yapıların aynı anda görüntülenebileceği seçimini sınırlarlar. Öte yandan, FP’ler genellikle çok çeşitli şekillerde bulunur; Örneğin, UV / mavi spektrumdaki Autodot’tan uzak kırmızı spektrumdaki Lipidtox ve LipidSpot 610’a kadar emisyon spektrumları ile çeşitli lipit-damlacık spesifik boyalar mevcuttur. FP’ler ayrıca herhangi bir ilgi alanına doğrudan uygulanabilir ve bu nedenle, örneğin, istenen organel işaretleyicisini mutant bir ilgi suşuna sokmak için gerinim yapısı gerektirmez. Bu avantaj, birden fazla yapının aynı anda etiketlenmesi gerektiğinde özellikle belirgindir; Birden fazla nesle yayılan zaman alıcı haçlar yerine, ilgili boyaların karıştırılması ve aynı anda tanıtılmasıyla tek bir günde bu elde edilebilir. Son olarak, hücresel süreçler farmakolojik inhibisyon ile araştırılacaksa, ilaçlar ve boyalar birlikte tanıtılabilir.
Etiketsiz yöntemler, belirli hücresel yapıları tespit etmek için çok güçlü yaklaşımlardır. Örneğin, LD’ler erken embriyolarda üçüncü harmonik nesil mikroskopi20 veya femtosaniye Uyarılmış Raman Kaybı mikroskobu21 ile spesifik olarak tespit edilebilir. FP’ler gibi, bu yaklaşımlar da herhangi bir genetik arka planda uygulanabilir ve ağartmaya neden olmadıkları için potansiyel olarak daha hızlı görüntü elde edilmesine izin verirler. Bununla birlikte, tipik olarak belirli organellerle sınırlıdırlar ve bu nedenle kendi başlarına multipleks görüntülemeyi desteklemezler; ayrıca özel mikroskoplar gerektirirler.
Küçük molekülleri embriyolara sokmak için iki genel strateji vardır. Birincisi, burada kullanılan mikroenjeksiyon yaklaşımı; diğeri ise vitelin membranı geçirgenleştirmek için kimyasal (terpen) işlemdir. İkinci yaklaşım12 , mikroenjeksiyondan daha az ilgilidir, ancak embriyodan embriyoya daha değişkendir. Ek olarak, geçirgenlikten sonra, vitelin membranı tarafından sağlanan koruma tehlikeye girer ve embriyo dış ortama uygun şekilde erişilebilir hale gelir, bu da onu canlı tutmayı daha zor hale getirir. Mikroenjeksiyonun embriyonik gelişimi raydan çıkarma olasılığı geçirgenlikten çok daha düşüktür. Bununla birlikte, birçok embriyonun aynı anda izlenmesi gerekiyorsa, örneğin ilaç taraması amacıyla permeabilizasyon önerilir. Hücresel yapıların hareketini takip etmek ve görüntü analizine uygun tekrarlanabilir görüntü serileri elde etmek için mikroenjeksiyon tercih edilen yöntemdir.
Yöntemin belirli araştırma alanlarındaki önemi ve potansiyel uygulamaları
Drosophila embriyosu, birçok hücre-biyolojik ve gelişimsel süreci incelemek için önemli bir model sistemdir 1,5,6. Organelleri floresan proteinlerle etiketlemek, erken embriyonun nasıl geliştiğinin, çeşitli organellerin nasıl trafiğe çıktığının ve bu tür kaçakçılığın gelişimsel ve genetik olarak nasıl modüle edildiğinin anlaşılmasına büyük katkılarda bulunmuştur. Bununla birlikte, ağartma eğilimleri ve birden fazla organelin farklı renklerle etiketlendiği suşlar üretme zorlukları bu yaklaşımın uygulanmasını sınırlar. Mikroenjeksiyon ile tanıtılan FP’lerin kullanımı bu zorlukların çoğunu çözer ve hatta floresan olarak etiketlenmiş proteinlerle birleştirilebilir. Bu teknik, herhangi bir genetik arka planda çoklu organellerin, hücre yapılarının ve sitoiskelet bileşenlerinin görüntülenmesini sağlar. Sonuç olarak, canlı görüntüleme yoluyla çeşitli genotipler karşılaştırılabilir ve bu da mutasyonların çoklu organel kaçakçılığı üzerindeki etkisini belirlemeyi mümkün kılar.
Bu protokol, Drosophila melanogaster’in embriyoları için FP enjeksiyon yaklaşımını göstermektedir, ancak prensip olarak, bu yaklaşım, diğer Drosophila türleri, cırcır böcekleri22 ve yaprak bitleri23 de dahil olmak üzere mikroenjeksiyon tekniklerinin oluşturulduğu herhangi bir böcek yumurtası için geçerlidir.
The authors have nothing to disclose.
Pakinee Phromsiri, Brian Jencik, Jinghong (James) Tang ve Roger White’a el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. Patrick Oakes, Stefano Di Talia ve Victoria Deneke’ye PIV analizinin nasıl yapılacağı konusundaki uzmanlıklarını paylaştıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri F31 HD100127 (M. D. K.) ve R01 GM102155 (M. A. W’ye) hibeleri tarafından desteklenmiştir.
AUTODO | abcepta | SM1000a | Stains lipid droplets in violet/blue |
BODIPY 493/503 | ThermoFisher | D3922 | Stains lipid droplets in green |
Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite | W.A. Hammond Drierite Company | 21001 | |
Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base | Zeiss | 4350030000000000 | |
Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape | Scotch (3M) | – | Sold by many vendors |
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide) | ThermoFisher | E34251 | Stains the ER/nuclear envelope |
Femptotip II | Eppendorf | H129354N | Ready to use |
Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in | World Precision Instruments | TW100F-4 | Must be pulled |
Glass coverslip | – | – | Buy the appropriate refractive index for your objective lens |
Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned | FisherBrand | 12-550-343 | |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | |
Heptane greener alternative anhydrous, 99% |
Sigma-Aldrich | 246654-1L | Heptane is considered toxic by the USA's OSHA |
Confocal microscope | Leica | Sp5 | Many different types of confocal microscopes will work. |
LipidSpot 610 | Biotium | #70069 | Stains lipid droplets in far red |
LysoTracker Red | ThermoFisher | L7528 | Stains lysosomes in red |
MitoView 633 | Biotium | #70055 | Stains mitochondria |
Needle loading pipette tips – 20uL microloader tips | Eppendorf | # 5242956.003 | |
P-1000, Next Generation Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1×1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip. |
SiR-Tubulin | Cytosketon Inc | CY-SC014 | Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red |
TransferMan | Eppendorf | 5178 NK | |
ViaFluor 405 | Biotium | #70064 | Stains microtubules in violet/blue |