Culture de lymphocytes en microgravité simulée à l’aide d’un système de culture cellulaire rotatif
Summary
Il s’agit d’un guide étape par étape pour l’utilisation d’un système de culture cellulaire rotative disponible dans le commerce pour cultiver des lymphocytes en microgravité simulée à l’aide de récipients de culture jetables spécialisés. Cette méthode de culture peut être appliquée à toute culture cellulaire de type suspension.
Abstract
Compte tenu des limites actuelles de la recherche biologique dans l’espace, il existe quelques options pour soumettre la culture cellulaire à la microgravité simulée (SMG) sur Terre. Ces options varient dans leurs méthodes, leurs principes et leur aptitude à être utilisées avec la culture cellulaire en suspension. Ici, une méthode de culture cellulaire est décrite pour soumettre les lymphocytes à une microgravité simulée à l’aide d’un système de culture cellulaire rotative disponible dans le commerce, également connu sous le nom de clinostat 2D ou de dispositif de récipient à paroi rotative (RWV). Cette méthode de culture cellulaire utilise le principe de l’annulation du vecteur de gravité moyenné dans le temps pour simuler la microgravité en faisant tourner les cellules sur un axe horizontal. Les cellules cultivées dans ce système peuvent être récoltées et utilisées dans de nombreux tests expérimentaux différents pour évaluer les effets de la microgravité simulée sur la fonction cellulaire et la physiologie. La technique de culture peut varier légèrement selon le type de cellule ou la lignée utilisée, mais la méthode décrite ici peut être appliquée à toute culture cellulaire de type suspension.
Introduction
Il a été démontré que les vols spatiaux ont un impact sur de nombreux aspects de la physiologie humaine, y compris le système immunitaire. De nombreuses études ont démontré des signes de dérégulation immunitaire à la suite de vols spatiaux in vivo et d’exposition à la microgravité simulée (SMG) in vitro 1,2,3,4. Un aspect majeur de l’environnement spatial qui a un impact sur la physiologie humaine est la microgravité. La microgravité fait référence à « l’apesanteur » ressentie en raison des faibles forces gravitationnelles dans l’environnement spatial5. Alors que l’humanité se prépare à des missions spatiales plus longues vers la Lune et Mars, davantage de recherches doivent être menées pour atténuer les risques graves pour la santé des astronautes.
Des conditions réelles de microgravité pour la recherche scientifique peuvent être obtenues dans l’espace à bord de la Station spatiale internationale (ISS) ou dans des nanosatellites lancés en orbite; Cependant, ces options peuvent être incroyablement coûteuses et complexes à orchestrer. Compte tenu des limites actuelles de la recherche biologique dans l’espace, plusieurs options existent pour induire une microgravité réelle et SMG sur Terre. Il existe des opérations à grande échelle qui peuvent produire de courtes périodes de microgravité réelle sur Terre, y compris des tours de largage, des vols paraboliques et des fusées-sondes. Cependant, ces méthodes ne sont pas trop adaptées à l’étude des effets de la microgravité sur les systèmes biologiques, en grande partie en raison de leurs courtes périodes de traitement en microgravité (c.-à-d. de quelques secondes à 20 minutes). Ces méthodes sont examinées plus en détail ailleurs 5,6. Les options adaptées à la culture cellulaire biologique comprennent des dispositifs à petite échelle tels que des clinostats 2D ou des dispositifs à cuve à paroi rotative (RWV) et des clinostats 3D ou des machines de positionnement aléatoire (RPM). Ces dispositifs peuvent être installés à l’intérieur d’incubateurs de culture cellulaire maintenus à 37 °C et 5% de CO2, et ils font tourner la culture cellulaire soit sur un axe horizontal (2D), soit sur deux axes perpendiculaires (3D)5. Cependant, il est important de souligner que ces méthodes de culture produisent du SMG par opposition à la microgravité réelle, qui est la plus réalisable dans l’espace pour les contextes de recherche biologique.
L’objectif du présent article est de décrire les étapes à suivre pour soumettre les lymphocytes à l’ASG à l’aide d’un dispositif RWV (Table of Materials) disponible dans le commerce, qui relève de la classification clinostat 2D. Bien qu’il existe un protocole général disponible auprès du fabricant pour l’utilisation de cet appareil, le présent article vise à couvrir les étapes de dépannage et d’optimisation plus en détail. Cet article couvre également la théorie derrière la façon dont ce dispositif fonctionne pour produire du SMG en culture cellulaire en suspension, en particulier avec des lymphocytes. Dans ce contexte, la culture cellulaire en suspension fait référence aux cellules qui se développent librement dans des milieux de culture supplémentés, sans adhérer à un échafaudage supplémentaire. De nombreux types de cellules sont cultivés en culture cellulaire en suspension, y compris les lymphocytes. Les lymphocytes sont des cellules du système immunitaire, y compris les cellules T, B et Natural Killer (NK), qui résident dans les organes lymphoïdes et la circulation sanguine7.
Le clinostat RWV 2D décrit ici fonctionne sur le principe de l’annulation du vecteur de gravité moyenné dans le temps 5,6,8,9, selon lequel le vecteur de gravité est randomisé par rotation de la culture cellulaire sur un axe horizontal. Ceci est réalisé en faisant correspondre la vitesse de rotation du récipient de culture à la vitesse de sédimentation des cellules. Tant que la vitesse de rotation du récipient de culture correspond bien à la vitesse de sédimentation des cellules, les cellules sont maintenues en chute libre et incapables de sédimenter, comme c’est le cas dans l’environnement spatial. Après une phase initiale d’accélération, le milieu dans le récipient de culture atteint finalement la « rotation du corps solide » au fil du temps. Cette rotation horizontale induit également un écoulement laminaire dans le récipient de culture cellulaire. Cela crée un environnement de « faible cisaillement », étant donné que la contrainte de cisaillement induite sur les cellules par l’écoulement laminaire est bien inférieure à celle de l’écoulement turbulent. Cependant, étant donné que le clinostat n’est pas un système parfait, de petits mouvements de fluide laminaire sont introduits, qui infligent une contrainte de cisaillement minimale aux cellules. En tant que telles, les cellules en suspension dans le milieu sont entraînées par ce flux pendant la rotation. Pendant la rotation horizontale, le vecteur de gravité agit sur les cellules et les amène dans une trajectoire oscillante, comme le montre la figure 1. Une autre petite source de contrainte de cisaillement est causée par les cellules qui « tombent » à travers le milieu, provoquant un flux laminaire autour des cellules. Lorsque le récipient de culture tourne sur un axe horizontal, le vecteur de gravité subi par les cellules tourne également. Au fil du temps, ce vecteur gravitationnel rotatif se rapproche de zéro; ce phénomène est appelé nullification du vecteur de gravité moyen dans le temps et induit un état de SMG 5,6,8,9. Ce dispositif a été utilisé pour étudier les effets du SMG sur de nombreux types de cellules, dont certaines sont couvertes dans les références10,11,12. Vous trouverez d’autres exemples sur le site Web du fabricant de l’appareil.
Cet appareil RWV utilise des « vaisseaux à rapport d’aspect élevé » (HARV) spécialisés disponibles auprès du fabricant de l’appareil. Ces HARV contiennent 10 mL de culture cellulaire chacun; cependant, des VHR de 50 mL sont également disponibles. Des HARV de 10 mL ou de 50 mL peuvent être utilisés selon le nombre de cellules nécessaires pour effectuer les essais expérimentaux en aval, ce qui est décrit plus en détail dans la section de discussion. Les HARV sont faits de polycarbonate et comprennent une membrane d’oxygénation en silicone pour permettre l’échange gazeux pendant la culture cellulaire. Cela maintient le pH du milieu cellulaire et permet une respiration cellulaire efficace. Il y a un orifice de remplissage principal et deux orifices de seringue bouchés sur la face du navire (figure 2A). Après le chargement de la culture cellulaire par l’orifice de remplissage principal, deux seringues sont chargées sur le récipient pour aider à l’élimination des bulles. Lors de l’utilisation des vaisseaux de 10 mL, deux seringues de 3 mL fonctionnent bien. Une seringue est fixée au dispositif vide, la seringue est complètement enfoncée et l’autre est fixée remplie de 3 mL de culture cellulaire (figure 2E). Ceux-ci sont utilisés en combinaison pour éliminer les bulles du récipient, ce qui est important pour maintenir le traitement SMG. En général, il est conseillé de mettre en place deux contrôles négatifs, que l’on peut appeler le contrôle « Flask » et le contrôle « 1G ». Le témoin « Flask » correspond aux cellules cultivées dans un ballon de culture cellulaire en suspension standard T25. Le contrôle 1G correspond aux cellules qui sont cultivées dans le récipient de culture spécialisé de 10 mL, qui est simplement placé dans l’incubateur (c’est-à-dire sans être soumis au traitement SMG). Veuillez consulter la section Discussion pour plus de détails sur les contrôles.
La méthode décrite ici convient à tout chercheur cherchant à étudier les effets du SMG sur les lymphocytes, en mettant l’accent sur les cellules NK en utilisant la lignée cellulaire NK9213. Les résultats de ces études pourraient nous aider à mieux comprendre et atténuer les effets néfastes des vols spatiaux sur le système immunitaire humain.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alors que l’humanité se prépare à des missions spatiales plus longues vers la Lune et Mars, davantage de recherches doivent être menées pour atténuer les risques graves pour la santé des astronautes. Un aspect majeur de l’environnement spatial qui a un impact sur la physiologie humaine est la microgravité. Ici, une méthode de culture cellulaire a été décrite pour soumettre les lymphocytes à l’ASG à l’aide d’un système de culture cellulaire rotative disponible dans le commerce.
<p class="jove_…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux sont financés par une subvention de recherche de l’Agence spatiale canadienne (ASC) (17ILSRA3, Immuno-Profile). Les auteurs aimeraient remercier la Dre Roxanne Fournier (Université de Toronto), le Dr Randal Gregg (Université Lincoln Memorial) et Preteesh Mylabathula (Université de l’Arizona) pour leur aide dans le dépannage initial de ce protocole.
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
Referências
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. . The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).
- Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
- Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station – relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
- Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
- Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
- Murphy, K., Weaver, C. . Janeway’s Immunobiology 9th Edition. , (2016).
- Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
- Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
- Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
- Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
- Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
- Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022)
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022)
- Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
- Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
- Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
- Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
- Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).
