زراعة الخلايا الليمفاوية في محاكاة الجاذبية الصغرى باستخدام نظام زراعة الخلايا الدوارة
Summary
هذا دليل خطوة بخطوة لاستخدام نظام زراعة الخلايا الدوارة المتاح تجاريا لزرع الخلايا الليمفاوية في محاكاة الجاذبية الصغرى باستخدام أوعية استزراع متخصصة يمكن التخلص منها. يمكن تطبيق طريقة الاستزراع هذه على أي مزرعة خلايا من نوع التعليق.
Abstract
بالنظر إلى القيود الحالية لإجراء البحوث البيولوجية في الفضاء ، توجد بعض الخيارات لإخضاع زراعة الخلايا لمحاكاة الجاذبية الصغرى (SMG) على الأرض. تختلف هذه الخيارات في أساليبها ومبادئها ومدى ملاءمتها للاستخدام مع مزرعة الخلايا المعلقة. هنا ، يتم وصف طريقة زراعة الخلايا لإخضاع الخلايا الليمفاوية لمحاكاة الجاذبية الصغرى باستخدام نظام زراعة الخلايا الدوارة المتاح تجاريا ، والمعروف أيضا باسم clinostat 2D أو جهاز وعاء الجدار الدوار (RWV). تستخدم طريقة زراعة الخلايا هذه مبدأ إبطال ناقل الجاذبية المتوسط زمنيا لمحاكاة الجاذبية الصغرى عن طريق تدوير الخلايا على محور أفقي. يمكن حصاد الخلايا المستزرعة في هذا النظام واستخدامها في العديد من المقايسات التجريبية المختلفة لتقييم آثار محاكاة الجاذبية الصغرى على الوظيفة الخلوية وعلم وظائف الأعضاء. قد تختلف تقنية الاستزراع قليلا اعتمادا على نوع الخلية أو الخط المستخدم ، ولكن يمكن تطبيق الطريقة الموضحة هنا على أي مزرعة خلية من نوع التعليق.
Introduction
لقد ثبت أن رحلات الفضاء تؤثر على العديد من جوانب علم وظائف الأعضاء البشرية ، بما في ذلك جهاز المناعة. أظهرت العديد من الدراسات أدلة على عدم التنظيم المناعي نتيجة لرحلات الفضاء في الجسم الحي والتعرض لمحاكاة الجاذبية الصغرى (SMG) في المختبر1،2،3،4. ومن الجوانب الرئيسية للبيئة الفضائية التي تؤثر على فسيولوجيا الإنسان الجاذبية الصغرى. تشير الجاذبية الصغرى إلى “انعدام الوزن” الذي يحدث بسبب قوى الجاذبية المنخفضة في بيئة الفضاء5. بينما تستعد البشرية لبعثات فضائية أطول إلى القمر والمريخ ، يجب إجراء المزيد من الأبحاث للتخفيف من المخاطر الصحية الخطيرة على رواد الفضاء.
ويمكن تحقيق ظروف الجاذبية الصغرى الحقيقية للبحث العلمي في الفضاء على متن محطة الفضاء الدولية (ISS) أو في السواتل النانوية التي تطلق في المدار؛ ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الخيارات مكلفة للغاية ومعقدة للتنسيق. بالنظر إلى القيود الحالية لإجراء البحوث البيولوجية في الفضاء ، توجد عدة خيارات لإحداث جاذبية صغيرة حقيقية و SMG على الأرض. توجد عمليات واسعة النطاق يمكن أن تنتج فترات قصيرة من الجاذبية الصغرى الحقيقية على الأرض ، بما في ذلك أبراج الإسقاط ، والطيران المكافئ ، وصواريخ السبر. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق ليست مناسبة بشكل مفرط لدراسة آثار الجاذبية الصغرى على النظم البيولوجية ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى فترات قصيرة من معالجة الجاذبية الصغرى (أي ثوان إلى 20 دقيقة). تتم مناقشة هذه الأساليب بمزيد من التفصيل في مكان آخر 5,6. تشمل الخيارات المناسبة لزراعة الخلايا البيولوجية الأجهزة الصغيرة الحجم مثل 2D clinostats أو أجهزة وعاء الجدار الدوار (RWV) و clinostats 3D أو آلات تحديد المواقع العشوائية (RPM). يمكن إعداد هذه الأجهزة داخل حاضنات زراعة الخلايا التي يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، وتقوم بتدوير ثقافة الخلية إما على محور أفقي (2D) أو على محورين عموديين (3D) 5. ومع ذلك ، من المهم التأكيد على أن طرق الاستزراع هذه تنتج رشاشات صغيرة بدلا من الجاذبية الصغرى الحقيقية ، والتي يتم تحقيقها بشكل عملي في الفضاء لسياقات البحث البيولوجي.
الهدف من الورقة الحالية هو تحديد خطوات إخضاع الخلايا الليمفاوية ل SMG باستخدام جهاز RWV المتاح تجاريا (جدول المواد) ، والذي يندرج تحت تصنيف clinostat 2D. على الرغم من وجود بروتوكول عام متاح من الشركة المصنعة لتشغيل هذا الجهاز ، تهدف المقالة الحالية إلى تغطية خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحسين بمزيد من التفصيل. تغطي هذه المقالة أيضا النظرية الكامنة وراء كيفية عمل هذا الجهاز لإنتاج SMG في ثقافة الخلايا المعلقة ، وتحديدا مع الخلايا الليمفاوية. في هذا السياق ، تشير زراعة الخلايا المعلقة إلى الخلايا التي تنمو بحرية في وسائط الاستزراع التكميلية ، دون الالتزام بأي سقالات إضافية. تزرع العديد من أنواع الخلايا في زراعة الخلايا المعلقة ، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية. الخلايا الليمفاوية هي خلايا الجهاز المناعي ، بما في ذلك الخلايا التائية والبائية والقاتلة الطبيعية (NK) ، الموجودة في الأعضاء اللمفاوية ومجرى الدم7.
يعمل كلينستات RWV 2D الموصوف هنا على مبدأ إبطال متجه الجاذبية متوسط الوقت5،6،8،9 ، حيث يتم اختيار متجه الجاذبية بشكل عشوائي من خلال دوران ثقافة الخلية على محور أفقي. يتم تحقيق ذلك من خلال مطابقة سرعة دوران وعاء الاستزراع مع سرعة ترسيب الخلايا. وطالما أن سرعة دوران وعاء الاستزراع تتطابق بشكل جيد مع سرعة ترسيب الخلايا، فإن الخلايا تظل في حالة سقوط حر وغير قادرة على الترسب، كما حدث في بيئة الفضاء. بعد مرحلة التسريع الأولية ، تصل الوسائط في وعاء الاستزراع في النهاية إلى “دوران الجسم الصلب” بمرور الوقت. يحفز هذا الدوران الأفقي أيضا التدفق الصفحي في وعاء زراعة الخلايا. هذا يخلق بيئة “قص منخفضة” ، بالنظر إلى أن إجهاد القص الناجم عن الخلايا عن طريق التدفق الصفحي أقل بكثير من التدفق المضطرب. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن clinostat ليس نظاما مثاليا ، فهناك بعض حركات السوائل الصفائحية الصغيرة التي يتم إدخالها ، والتي تسبب الحد الأدنى من إجهاد القص على الخلايا. على هذا النحو ، يتم سحب الخلايا المعلقة في الوسائط بواسطة هذا التدفق أثناء الدوران. أثناء الدوران الأفقي، يؤثر متجه الجاذبية على الخلايا ويضعها في مسار متذبذب، كما هو موضح في الشكل 1. مصدر صغير آخر لإجهاد القص ناتج عن “سقوط” الخلايا عبر الوسائط ، مما يتسبب في تدفق رقائقي حول الخلايا. عندما يدور وعاء الاستزراع على محور أفقي ، يدور ناقل الجاذبية الذي تتعرض له الخلايا أيضا. بمرور الوقت ، يقترب متوسط ناقل الجاذبية الدوار هذا من الصفر. تسمى هذه الظاهرة إبطال ناقل الجاذبية المتوسط الزمني وتؤدي إلى حالة SMG5،6،8،9. تم استخدام هذا الجهاز لدراسة آثار SMG على العديد من أنواع الخلايا ، والتي يتم تغطية بعضها في المراجع10،11،12. يمكن العثور على المزيد من الأمثلة على موقع الشركة المصنعة للجهاز.
يستخدم جهاز RWV هذا “أوعية ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية” (HARVs) متخصصة متوفرة من خلال الشركة المصنعة للجهاز. تحتوي هذه HARVs على 10 مل من زراعة الخلايا لكل منها. ومع ذلك ، تتوفر أيضا 50 مل من HARVs. يمكن استخدام 10 مل أو 50 مل HARVs اعتمادا على عدد الخلايا اللازمة لإكمال أي فحوصات تجريبية نهائية ، والتي تم توضيحها بمزيد من التفصيل في قسم المناقشة. تصنع HARVs من البولي كربونات وتشمل غشاء أكسجة السيليكون للسماح بتبادل الغازات أثناء زراعة الخلايا. وهذا يحافظ على الأس الهيدروجيني للوسائط الخلوية ويسمح بالتنفس الخلوي بكفاءة. يوجد منفذ تعبئة رئيسي ومنفذي حقنة مغطاة على وجه الوعاء (الشكل 2 أ). بعد تحميل مزرعة الخلية من خلال منفذ التعبئة الرئيسي ، يتم تحميل حقنتين على الوعاء للمساعدة في إزالة الفقاعة. عند استخدام الأوعية سعة 10 مل ، تعمل حقنتان سعة 3 مل بشكل جيد. يتم توصيل حقنة واحدة بالجهاز فارغة ، مع الضغط التام على المحقنة ، والأخرى متصلة مملوءة ب 3 مل من زراعة الخلايا (الشكل 2E). يتم استخدامها معا لإزالة الفقاعات من الوعاء ، وهو أمر مهم للحفاظ على علاج SMG. بشكل عام ، ينصح بإعداد عنصري تحكم سلبيين ، يمكن الإشارة إليهما باسم عنصر التحكم “Flask” وعنصر التحكم “1G”. يتوافق عنصر التحكم “القارورة” مع الخلايا التي تزرع في قارورة ثقافة الخلايا المعلقة T25 القياسية. يتوافق عنصر التحكم 1G مع الخلايا التي تزرع في وعاء الاستزراع المتخصص سعة 10 مل ، والذي يتم وضعه ببساطة في الحاضنة (أي دون التعرض لعلاج SMG). يرجى الاطلاع على قسم المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل حول عناصر التحكم.
الطريقة الموصوفة هنا مناسبة لأي باحث يتطلع إلى دراسة آثار SMG على الخلايا الليمفاوية ، مع التركيز بشكل خاص على الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام خط الخلية NK9213. قد تساعدنا نتائج هذه الدراسات على فهم أفضل وتخفيف الآثار الضارة لرحلات الفضاء على جهاز المناعة البشري.
Protocol
Representative Results
Discussion
بينما تستعد البشرية لبعثات فضائية أطول إلى القمر والمريخ ، يجب إجراء المزيد من الأبحاث للتخفيف من المخاطر الصحية الخطيرة على رواد الفضاء. ومن الجوانب الرئيسية للبيئة الفضائية التي تؤثر على فسيولوجيا الإنسان الجاذبية الصغرى. هنا ، تم وصف طريقة زراعة الخلايا لإخضاع الخلايا الليمفاوية لرش?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من قبل وكالة الفضاء الكندية (CSA) ، منحة بحثية (17ILSRA3 ، الملف المناعي). يود المؤلفون أن يشكروا وشكروا الدكتورة روكسان فورنييه (جامعة تورنتو) والدكتور راندال جريج (جامعة لينكولن التذكارية) وبريتيش ميلاباثولا (جامعة أريزونا) على مساعدتهم في استكشاف الأخطاء وإصلاحها الأولية لهذا البروتوكول.
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
Referências
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. . The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).
- Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
- Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station – relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
- Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
- Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
- Murphy, K., Weaver, C. . Janeway’s Immunobiology 9th Edition. , (2016).
- Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
- Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
- Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
- Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
- Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
- Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022)
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022)
- Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
- Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
- Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
- Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
- Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).
