Dyrkning af lymfocytter i simuleret mikrogravitation ved hjælp af et roterende cellekultursystem
Summary
Dette er en trinvis vejledning til brug af et kommercielt tilgængeligt roterende cellekultursystem til dyrkning af lymfocytter i simuleret mikrogravitation ved hjælp af specialiserede engangskulturbeholdere. Denne dyrkningsmetode kan anvendes på enhver cellekultur af suspensionstypen.
Abstract
I betragtning af de nuværende begrænsninger ved at udføre biologisk forskning i rummet findes der nogle få muligheder for at udsætte cellekultur for simuleret mikrogravitation (SMG) på Jorden. Disse muligheder varierer i deres metoder, principper og egnethed til brug med suspensionscellekultur. Her beskrives en cellekulturmetode til at udsætte lymfocytter for simuleret mikrogravitation ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt roterende cellekultursystem, også kendt som en 2D clinostat eller en roterende vægbeholder (RWV) enhed. Denne cellekulturmetode anvender princippet om tidsgennemsnitlig gravitationsvektorannullering til at simulere mikrogravitation ved at rotere cellerne på en vandret akse. De celler, der dyrkes i dette system, kan høstes og anvendes i mange forskellige eksperimentelle assays for at vurdere virkningerne af simuleret mikrogravitation på cellulær funktion og fysiologi. Dyrkningsteknikken kan variere lidt afhængigt af den celletype eller linje, der anvendes, men metoden beskrevet her kan anvendes på enhver suspensionscellekultur.
Introduction
Rumflyvning har vist sig at påvirke mange aspekter af menneskelig fysiologi, herunder immunsystemet. Mange undersøgelser har vist tegn på immundysregulering som følge af rumflyvning in vivo og eksponering for simuleret mikrogravitation (SMG) in vitro 1,2,3,4. Et vigtigt aspekt af rummiljøet, der påvirker menneskelig fysiologi, er mikrogravity. Mikrogravitation refererer til den “vægtløshed”, der opleves på grund af lave tyngdekræfter i rummiljøet5. Da menneskeheden forbereder sig på længere rummissioner til Månen og Mars, skal der udføres mere forskning for at afbøde alvorlige sundhedsrisici hos astronauter.
Der kan opnås reelle betingelser for mikrotyngdekraft for videnskabelig forskning i rummet ombord på Den Internationale Rumstation (ISS) eller i nanosatellitter, der sendes i kredsløb; Disse muligheder kan dog være utroligt dyre og komplekse at orkestrere. I betragtning af de nuværende begrænsninger ved at udføre biologisk forskning i rummet findes der flere muligheder for at fremkalde reel mikrogravitation og SMG på Jorden. Der findes store operationer, der kan producere korte perioder med reel mikrogravitation på Jorden, herunder droptårne, parabolflyvning og lydende raketter. Disse metoder er imidlertid ikke alt for egnede til at studere virkningerne af mikrogravitation på biologiske systemer, hovedsageligt på grund af deres korte perioder med mikrogravitybehandling (dvs. sekunder til 20 minutter). Disse metoder behandles mere detaljeret andetsteds 5,6. Valgmuligheder, der er egnede til biologisk cellekultur, omfatter små enheder såsom 2D-klinostater eller roterende vægbeholder (RWV) enheder og 3D-klinostater eller tilfældige positioneringsmaskiner (RPM). Disse enheder kan opstilles inde i cellekulturinkubatorer, der opretholdes ved 37 °C og 5% CO2, og de roterer cellekulturen enten på en vandret akse (2D) eller på to vinkelrette akser (3D)5. Det er dog vigtigt at understrege, at disse dyrkningsmetoder producerer SMG i modsætning til reel mikrogravitation, som mest gennemførligt opnås i rum til biologiske forskningssammenhænge.
Målet med det nuværende papir er at skitsere trinene til at udsætte lymfocytter for SMG ved hjælp af en kommercielt tilgængelig RWV-enhed (materialetabel), der falder ind under 2D-clinostatklassifikationen. Selvom der er en generel protokol tilgængelig fra producenten til betjening af denne enhed, har den aktuelle artikel til formål at dække fejlfindings- og optimeringstrinnene mere detaljeret. Denne artikel dækker også teorien bag, hvordan denne enhed fungerer til at producere SMG i suspensionscellekultur, specifikt med lymfocytter. I denne sammenhæng henviser suspensionscellekultur til celler, der vokser frit i supplerede kulturmedier uden at klæbe til yderligere stilladser. Mange celletyper dyrkes i suspensionscellekultur, herunder lymfocytter. Lymfocytter er celler i immunsystemet, herunder T, B og Natural Killer (NK) celler, der befinder sig i lymfoide organer og blodbanen7.
RWV 2D clinostaten beskrevet her fungerer på princippet om tidsgennemsnitlig gravitationsvektor nullificering 5,6,8,9, hvorved tyngdekraftsvektoren randomiseres gennem rotation af cellekulturen på en vandret akse. Dette opnås ved at matche kulturbeholderens rotationshastighed med cellernes sedimentationshastighed. Så længe kulturbeholderens rotationshastighed er godt tilpasset cellernes sedimentationshastighed, opretholdes cellerne i frit fald og er ude af stand til at sedimentere, som det opleves i rummiljøet. Efter en indledende hastighedsfase når mediet i kulturbeholderen til sidst “solid kropsrotation” over tid. Denne vandrette rotation inducerer også laminær strømning i cellekulturbeholderen. Dette skaber et “lavt forskydningsmiljø”, da forskydningsspændingen induceret på cellerne af laminær strømning er meget mindre end den turbulente strømning. Men da clinostaten ikke er et perfekt system, introduceres der nogle små, laminære væskebevægelser, som påfører cellerne minimal forskydningsbelastning. Som sådan trækkes cellerne, der er suspenderet i mediet, med af denne strøm under rotation. Under vandret rotation virker tyngdekraftsvektoren på cellerne og bringer dem ind i en oscillerende bane, som visualiseret i figur 1. En anden lille kilde til forskydningsstress er forårsaget af, at cellerne “falder” gennem medierne, hvilket forårsager laminær strømning omkring cellerne. Når kulturbeholderen roterer på en vandret akse, roterer tyngdekraftsvektoren, som cellerne oplever, også. Over tid nærmer denne roterende tyngdekraftsvektor sig i gennemsnit nul; dette fænomen kaldes tidsgennemsnitlig gravitationsvektor nullificering og inducerer en tilstand af SMG 5,6,8,9. Denne enhed er blevet brugt til at studere virkningerne af SMG på mange typer celler, hvoraf nogle er dækket af referencer10,11,12. Du kan finde flere eksempler på enhedsproducentens websted.
Denne RWV-enhed bruger specialiserede “high aspect ratio vessels” (HARVs), der er tilgængelige via enhedsproducenten. Disse HARV’er indeholder 10 ml cellekultur hver; dog er 50 ml HARV’er også tilgængelige. Enten 10 ml eller 50 ml HARV’er kan bruges afhængigt af hvor mange celler der er nødvendige for at fuldføre eventuelle downstream eksperimentelle assays, som er skitseret yderligere i diskussionsafsnittet. HARV’erne er lavet af polycarbonat og inkluderer en silikoneoxygeneringsmembran for at muliggøre gasudveksling under cellekultur. Dette opretholder cellemediets pH og giver mulighed for effektiv cellulær respiration. Der er en hovedpåfyldningsport og to sprøjteporte med låg på beholderens overflade (figur 2A). Efter lastning af cellekulturen gennem hovedpåfyldningsporten lægges to sprøjter på beholderen for at hjælpe med fjernelse af bobler. Når du bruger beholderne på 10 ml, fungerer to 3 ml sprøjter godt. Den ene sprøjte er fastgjort til enheden tom, med sprøjten helt trykket ned, og den anden er fastgjort fyldt med 3 ml cellekultur (figur 2E). Disse bruges i kombination til at fjerne bobler fra beholderen, hvilket er vigtigt for at opretholde SMG-behandlingen. Generelt anbefales det at oprette to negative kontroller, der kan betegnes som “Flask” -kontrollen og “1G” -kontrollen. “Kolbekontrollen” svarer til celler, der dyrkes i en standard T25-suspensionscellekulturkolbe. 1G-kontrollen svarer til celler, der dyrkes i den specialiserede 10 ml kulturbeholder, som simpelthen placeres i inkubatoren (dvs. uden at blive udsat for SMG-behandlingen). Se afsnittet Diskussion for at få flere oplysninger om kontrolelementer.
Metoden beskrevet her er passende for enhver forsker, der ønsker at studere virkningerne af SMG på lymfocytter, med et specifikt fokus på NK-celler ved hjælp af NK92-cellelinje13. Resultaterne fra disse undersøgelser kan hjælpe os med bedre at forstå og afbøde de negative virkninger af rumflyvning på det menneskelige immunsystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da menneskeheden forbereder sig på længere rummissioner til Månen og Mars, skal der udføres mere forskning for at afbøde alvorlige sundhedsrisici hos astronauter. Et vigtigt aspekt af rummiljøet, der påvirker menneskelig fysiologi, er mikrogravity. Her er der beskrevet en cellekulturmetode til at udsætte lymfocytter for SMG ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt roterende cellekultursystem.
Denne protokol indeholder et par kritiske trin, der muligvis skal optimeres afhængigt af de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af Canadian Space Agency (CSA), forskningsbevilling (17ILSRA3, Immuno Profile). Forfattere vil gerne anerkende og takke Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) og Preteesh Mylabathula (University of Arizona) for deres hjælp med den indledende fejlfinding af denne protokol.
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
Referências
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. . The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).
- Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
- Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station – relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
- Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
- Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
- Murphy, K., Weaver, C. . Janeway’s Immunobiology 9th Edition. , (2016).
- Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
- Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
- Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
- Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
- Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
- Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022)
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022)
- Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
- Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
- Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
- Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
- Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).
