Het kweken van lymfocyten in gesimuleerde microzwaartekracht met behulp van een roterend celkweeksysteem
Summary
Dit is een stapsgewijze handleiding voor het gebruik van een in de handel verkrijgbaar roterend celkweeksysteem om lymfocyten te kweken in gesimuleerde microzwaartekracht met behulp van gespecialiseerde wegwerpkweekvaten. Deze kweekmethode kan worden toegepast op elke celcultuur van het suspensietype.
Abstract
Gezien de huidige beperkingen van het uitvoeren van biologisch onderzoek in de ruimte, bestaan er een paar opties voor het onderwerpen van celcultuur aan gesimuleerde microzwaartekracht (SMG) op aarde. Deze opties variëren in hun methoden, principes en geschiktheid voor gebruik met suspensiecelcultuur. Hier wordt een celkweekmethode beschreven voor het onderwerpen van lymfocyten aan gesimuleerde microzwaartekracht met behulp van een in de handel verkrijgbaar roterend celkweeksysteem, ook bekend als een 2D-clinostaat of een rotating wall vessel (RWV) -apparaat. Deze celkweekmethode maakt gebruik van het principe van tijdgemiddelde zwaartekrachtvector-nullificatie om microzwaartekracht te simuleren door de cellen op een horizontale as te roteren. De cellen die in dit systeem worden gekweekt, kunnen worden geoogst en gebruikt in veel verschillende experimentele testen om de effecten van gesimuleerde microzwaartekracht op de cellulaire functie en fysiologie te beoordelen. De kweektechniek kan enigszins variëren, afhankelijk van het celtype of de lijn die wordt gebruikt, maar de hier beschreven methode kan worden toegepast op elke celcultuur van het suspensietype.
Introduction
Van ruimtevaart is aangetoond dat het vele aspecten van de menselijke fysiologie beïnvloedt, waaronder het immuunsysteem. Veel studies hebben bewijs aangetoond van immuunontregeling als gevolg van ruimtevluchten in vivo en blootstelling aan gesimuleerde microzwaartekracht (SMG) in vitro 1,2,3,4. Een belangrijk aspect van de ruimteomgeving dat de menselijke fysiologie beïnvloedt, is microzwaartekracht. Microzwaartekracht verwijst naar de “gewichtloosheid” die wordt ervaren als gevolg van lage zwaartekrachten in de ruimteomgeving5. Terwijl de mensheid zich voorbereidt op langere ruimtemissies naar de maan en Mars, moet er meer onderzoek worden gedaan om ernstige gezondheidsrisico’s bij astronauten te beperken.
Echte microzwaartekrachtcondities voor wetenschappelijk onderzoek kunnen worden bereikt in de ruimte aan boord van het International Space Station (ISS) of in nanosatellieten die in een baan om de aarde worden gelanceerd; Deze opties kunnen echter ongelooflijk duur en complex zijn om te orkestreren. Gezien de huidige beperkingen van het uitvoeren van biologisch onderzoek in de ruimte, bestaan er verschillende opties voor het induceren van echte microzwaartekracht en SMG op aarde. Er bestaan grootschalige operaties die korte perioden van echte microzwaartekracht op aarde kunnen produceren, waaronder valtorens, parabolische vluchten en klinkende raketten. Deze methoden zijn echter niet overdreven geschikt voor het bestuderen van de effecten van microzwaartekracht op biologische systemen, grotendeels vanwege hun korte perioden van microzwaartekrachtbehandeling (d.w.z. seconden tot 20 minuten). Deze methoden worden elders nader besproken 5,6. Opties die geschikt zijn voor biologische celkweek zijn kleinschalige apparaten zoals 2D-clinostaten of rwv-apparaten (rotating wall vat) en 3D-clinostaten of random positioning machines (RPM). Deze apparaten kunnen worden opgesteld in celkweekincubatoren die op 37 °C en 5% CO2 worden gehouden, en ze roteren de celcultuur op een horizontale as (2D) of op twee loodrechte assen (3D)5. Het is echter belangrijk om te benadrukken dat deze kweekmethoden SMG produceren in tegenstelling tot echte microzwaartekracht, die het meest haalbaar is in de ruimte voor biologische onderzoekscontexten.
Het doel van dit artikel is om de stappen te schetsen voor het onderwerpen van lymfocyten aan SMG met behulp van een in de handel verkrijgbaar RWV-apparaat (Table of Materials), dat onder de 2D-clinostatclassificatie valt. Hoewel er een algemeen protocol beschikbaar is van de fabrikant voor het gebruik van dit apparaat, is het huidige artikel bedoeld om de stappen voor probleemoplossing en optimalisatie in meer detail te behandelen. Dit artikel behandelt ook de theorie achter hoe dit apparaat werkt om SMG te produceren in suspensiecelcultuur, met name met lymfocyten. In deze context verwijst suspensiecelcultuur naar cellen die vrij groeien in aangevulde kweekmedia, zonder zich te hechten aan extra steigers. Veel celtypen worden gekweekt in suspensiecelcultuur, waaronder lymfocyten. Lymfocyten zijn cellen van het immuunsysteem, waaronder T-, B- en Natural Killer (NK) -cellen, die zich in lymfoïde organen en de bloedbaan bevinden7.
De hier beschreven RWV 2D-clinostaat werkt volgens het principe van tijdgemiddelde zwaartekrachtvector-nullificatie 5,6,8,9, waarbij de zwaartekrachtvector wordt gerandomiseerd door rotatie van de celcultuur op een horizontale as. Dit wordt bereikt door de rotatiesnelheid van het kweekvat af te stemmen op de sedimentatiesnelheid van de cellen. Zolang de rotatiesnelheid van het kweekvat goed is afgestemd op de sedimentatiesnelheid van de cellen, worden de cellen in vrije val gehouden en kunnen ze niet bezinken, zoals ervaren in de ruimteomgeving. Na een eerste versnellingsfase bereiken de media in het kweekvat uiteindelijk na verloop van tijd “vaste lichaamsrotatie”. Deze horizontale rotatie induceert ook laminaire stroming in het celkweekvat. Dit creëert een “low shear” -omgeving, aangezien de schuifspanning die door laminaire stroming op de cellen wordt veroorzaakt, veel minder is dan die van turbulente stroming. Aangezien de clinostaat echter geen perfect systeem is, zijn er enkele kleine, laminaire vloeistofbewegingen geïntroduceerd, die minimale schuifspanning op de cellen veroorzaken. Als zodanig worden de cellen die in de media zweven tijdens de rotatie door deze stroom meegesleurd. Tijdens horizontale rotatie werkt de zwaartekrachtvector op de cellen en brengt ze in een oscillerende baan, zoals gevisualiseerd in figuur 1. Een andere kleine bron van schuifspanning wordt veroorzaakt doordat de cellen door de media “vallen”, waardoor laminaire stroming rond de cellen ontstaat. Terwijl het kweekvat om een horizontale as draait, roteert ook de zwaartekrachtvector die de cellen ervaren. Na verloop van tijd nadert deze roterende zwaartekrachtvector gemiddeld nul; dit fenomeen wordt tijdgemiddelde zwaartekrachtvector-nullificatie genoemd en induceert een toestand van SMG 5,6,8,9. Dit apparaat is gebruikt om de effecten van SMG op vele soorten cellen te bestuderen, waarvan sommige worden behandeld in referenties10,11,12. Meer voorbeelden zijn te vinden op de website van de fabrikant van het apparaat.
Dit RWV-apparaat maakt gebruik van gespecialiseerde “high aspect ratio vessels” (HARV’s) die beschikbaar zijn via de fabrikant van het apparaat. Deze HARV’s bevatten elk 10 ml celkweek; er zijn echter ook 50 ml HARV’s beschikbaar. 10 ml of 50 ml HARV’s kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het aantal cellen dat nodig is om eventuele downstream experimentele assays te voltooien, wat verder wordt beschreven in de discussiesectie. De HARV’s zijn gemaakt van polycarbonaat en bevatten een siliconen oxygenatiemembraan om gasuitwisseling tijdens celkweek mogelijk te maken. Dit handhaaft de pH van de celmedia en zorgt voor een efficiënte cellulaire ademhaling. Er is een hoofdvulpoort en twee afgedekte spuitpoorten aan de voorkant van het vat (figuur 2A). Na het laden van de celcultuur door de hoofdvulpoort, worden twee spuiten op het vat geladen om te helpen bij het verwijderen van de luchtbel. Bij gebruik van de vaten van 10 ml werken twee spuiten van 3 ml goed. Eén spuit is leeg aan het apparaat bevestigd, met de spuit volledig ingedrukt, en de andere is gevuld met 3 ml celkweek (figuur 2E). Deze worden in combinatie gebruikt om bubbels uit het vat te verwijderen, wat belangrijk is voor het behoud van de SMG-behandeling. Over het algemeen wordt geadviseerd om twee negatieve controles in te stellen, die kunnen worden aangeduid als de “Flask” -controle en de “1G” -controle. De “Kolf”-regeling komt overeen met cellen die worden gekweekt in een standaard T25-suspensiecelkweekkolf. De 1G-controle komt overeen met cellen die worden gekweekt in het gespecialiseerde kweekvat van 10 ml, dat eenvoudig in de couveuse wordt geplaatst (d.w.z. zonder te worden onderworpen aan de SMG-behandeling). Zie het gedeelte Discussie voor meer informatie over besturingselementen.
De hier beschreven methode is geschikt voor elke onderzoeker die de effecten van SMG op lymfocyten wil bestuderen, met een specifieke focus op NK-cellen met behulp van de NK92-cellijn13. De resultaten van deze studies kunnen ons helpen de nadelige effecten van ruimtevaart op het menselijk immuunsysteem beter te begrijpen en te verzachten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terwijl de mensheid zich voorbereidt op langere ruimtemissies naar de maan en Mars, moet er meer onderzoek worden gedaan om ernstige gezondheidsrisico’s bij astronauten te beperken. Een belangrijk aspect van de ruimteomgeving dat de menselijke fysiologie beïnvloedt, is microzwaartekracht. Hier is een celkweekmethode beschreven voor het onderwerpen van lymfocyten aan SMG met behulp van een in de handel verkrijgbaar roterend celkweeksysteem.
Dit protocol bevat een paar kritieke stappen die moge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de Canadian Space Agency (CSA), onderzoeksbeurs (17ILSRA3, Immuno Profile). De auteurs willen Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) en Preteesh Mylabathula (University of Arizona) bedanken voor hun hulp bij het oplossen van dit protocol.
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
Referências
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. . The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).
- Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
- Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station – relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
- Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
- Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
- Murphy, K., Weaver, C. . Janeway’s Immunobiology 9th Edition. , (2016).
- Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
- Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
- Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
- Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
- Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
- Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022)
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022)
- Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
- Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
- Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
- Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
- Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).
