Cultivo de Linfócitos em Microgravidade Simulada utilizando Sistema de Cultura de Células Rotativas
Summary
Este é um guia passo a passo para o uso de um sistema de cultura de células rotativas comercialmente disponível para cultivar linfócitos em microgravidade simulada usando vasos de cultura descartáveis especializados. Este método de cultura pode ser aplicado a qualquer cultura celular do tipo suspensão.
Abstract
Dadas as limitações atuais da realização de pesquisas biológicas no espaço, existem algumas opções para submeter a cultura de células à microgravidade simulada (SMG) na Terra. Essas opções variam em seus métodos, princípios e adequação para uso com cultura de células em suspensão. Aqui, um método de cultura celular é descrito para submeter linfócitos a microgravidade simulada usando um sistema de cultura de células rotativas comercialmente disponível, também conhecido como clinostato 2D ou dispositivo de vaso de parede rotativa (RWV). Este método de cultura de células utiliza o princípio da anulação vetorial gravitacional em média no tempo para simular a microgravidade girando as células em um eixo horizontal. As células cultivadas neste sistema podem ser colhidas e utilizadas em diferentes ensaios experimentais para avaliar os efeitos da microgravidade simulada sobre a função e fisiologia celular. A técnica de cultivo pode variar ligeiramente dependendo do tipo ou linhagem celular utilizada, mas o método aqui descrito pode ser aplicado a qualquer cultura celular do tipo suspensão.
Introduction
Foi demonstrado que o voo espacial impacta muitos aspectos da fisiologia humana, incluindo o sistema imunológico. Muitos estudos têm demonstrado evidências de desregulação imunológica como resultado de voo espacial in vivo e exposição à microgravidade simulada (SMG) in vitro 1,2,3,4. Um aspecto importante do ambiente espacial que impacta a fisiologia humana é a microgravidade. A microgravidade refere-se à “ausência de gravidade” experimentada devido às baixas forças gravitacionais no ambiente espacial5. À medida que a humanidade se prepara para missões espaciais mais longas à Lua e a Marte, mais pesquisas precisam ser conduzidas para mitigar sérios riscos à saúde dos astronautas.
Condições reais de microgravidade para a pesquisa científica podem ser alcançadas no espaço a bordo da Estação Espacial Internacional (ISS) ou em nanossatélites lançados em órbita; No entanto, essas opções podem ser incrivelmente caras e complexas de orquestrar. Dadas as limitações atuais da realização de pesquisas biológicas no espaço, existem várias opções para induzir microgravidade real e SMG na Terra. Existem operações em grande escala que podem produzir curtos períodos de microgravidade real na Terra, incluindo torres de queda, voo parabólico e foguetes de sondagem. No entanto, esses métodos não são excessivamente adequados para estudar os efeitos da microgravidade em sistemas biológicos, em grande parte devido aos seus curtos períodos de tratamento de microgravidade (isto é, segundos a 20 min). Esses métodos são discutidos mais detalhadamente em outras publicações 5,6. As opções que são adequadas para cultura de células biológicas incluem dispositivos de pequena escala, como clinostatos 2D ou dispositivos de vasos de parede rotativa (RWV) e clinostatos 3D ou máquinas de posicionamento aleatório (RPM). Esses dispositivos podem ser instalados dentro de incubadoras de cultura celular mantidas a 37 °C e 5% CO2, e eles giram a cultura celular em um eixo horizontal (2D) ou em dois eixos perpendiculares (3D)5. No entanto, é importante enfatizar que esses métodos de cultivo produzem SMG em oposição à microgravidade real, que é mais viável no espaço para contextos de pesquisa biológica.
O objetivo do presente trabalho é delinear os passos para submeter linfócitos à SMG usando um dispositivo RWV comercialmente disponível (Tabela de Materiais), que se enquadra na classificação clinostat 2D. Embora haja um protocolo geral disponível do fabricante para operar este dispositivo, o artigo atual visa cobrir as etapas de solução de problemas e otimização com mais detalhes. Este artigo também aborda a teoria por trás de como este dispositivo funciona para produzir SMG em cultura de células em suspensão, especificamente com linfócitos. Nesse contexto, cultura de células em suspensão refere-se a células crescendo livremente em meios de cultura suplementados, sem aderir a nenhum andaime adicional. Muitos tipos celulares são cultivados em cultura de células em suspensão, incluindo linfócitos. Os linfócitos são células do sistema imune, incluindo as células T, B e Natural Killer (NK), que residem nos órgãos linfoides e na corrente sanguínea7.
O clinostato RWV 2D aqui descrito opera com base no princípio da anulação do vetor gravitacional em média no tempo 5,6,8,9, pelo qual o vetor gravitacional é randomizado através da rotação da cultura celular em um eixo horizontal. Isto é conseguido combinando a velocidade de rotação do vaso de cultura com a velocidade de sedimentação das células. Desde que a velocidade de rotação do vaso de cultura seja bem compatível com a velocidade de sedimentação das células, as células são mantidas em queda livre e incapazes de sedimentar, como experimentado no ambiente espacial. Após uma fase inicial de aceleração, o meio no vaso de cultura finalmente atinge a “rotação do corpo sólido” ao longo do tempo. Essa rotação horizontal também induz fluxo laminar no vaso de cultura celular. Isso cria um ambiente de “baixo cisalhamento”, dado que a tensão de cisalhamento induzida nas células pelo fluxo laminar é muito menor do que a do fluxo turbulento. No entanto, dado que o clinostato não é um sistema perfeito, há alguns pequenos movimentos de fluido laminar introduzidos, que infligem estresse de cisalhamento mínimo nas células. Como tal, as células suspensas no meio são arrastadas por esse fluxo durante a rotação. Durante a rotação horizontal, o vetor gravitacional atua sobre as células e as coloca em uma trajetória oscilante, conforme visualizado na Figura 1. Outra pequena fonte de tensão de cisalhamento é causada pela “queda” das células através do meio, causando fluxo laminar ao redor das células. À medida que o vaso de cultura gira em um eixo horizontal, o vetor gravitacional experimentado pelas células também gira. Com o tempo, esse vetor de gravidade giratório faz médias para se aproximar de zero; esse fenômeno é chamado de anulação do vetor gravitacional tempo-médio e induz um estado de SMG 5,6,8,9. Esse dispositivo tem sido utilizado para estudar os efeitos da SMG em diversos tipos de células, algumas das quais são abordadas emreferências10,11,12. Mais exemplos podem ser encontrados no site do fabricante do dispositivo.
Este dispositivo RWV usa “vasos de alta taxa de aspecto” (HARVs) especializados disponíveis através do fabricante do dispositivo. Esses HARVs contêm 10 mL de cultura celular cada; no entanto, HARVs de 50 mL também estão disponíveis. HARVs de 10 mL ou 50 mL podem ser usados dependendo de quantas células são necessárias para completar quaisquer ensaios experimentais a jusante, o que é descrito mais adiante na seção de discussão. Os HARVs são feitos de policarbonato e incluem uma membrana de oxigenação de silicone para permitir a troca gasosa durante a cultura celular. Isso mantém o pH do meio celular e permite uma respiração celular eficiente. Há uma porta de enchimento principal e duas portas de seringa tampadas na face do navio (Figura 2A). Depois de carregar a cultura celular através da porta de enchimento principal, duas seringas são carregadas no recipiente para ajudar na remoção de bolhas. Ao usar os vasos de 10 mL, duas seringas de 3 mL funcionam bem. Uma seringa é acoplada ao dispositivo vazia, com a seringa completamente deprimida, e a outra é anexada preenchida com 3 mL de cultura celular (Figura 2E). Estes são usados em combinação para remover bolhas do vaso, o que é importante para manter o tratamento SMG. Em geral, é aconselhável configurar dois controles negativos, que podem ser chamados de controle “Flask” e controle “1G”. O controle “Flask” corresponde às células que são cultivadas em um frasco padrão de cultura de células de suspensão T25. O controle 1G corresponde às células que são cultivadas no vaso de cultura especializado de 10 mL, que é simplesmente colocado na incubadora (ou seja, sem ser submetido ao tratamento SMG). Consulte a seção Discussão para obter mais detalhes sobre controles.
O método aqui descrito é apropriado para qualquer pesquisador que pretenda estudar os efeitos da SMG em linfócitos, com foco específico em células NK utilizando a linhagem celular NK9213. Os resultados desses estudos podem nos ajudar a entender melhor e mitigar os efeitos adversos dos voos espaciais no sistema imunológico humano.
Protocol
Representative Results
Discussion
À medida que a humanidade se prepara para missões espaciais mais longas à Lua e a Marte, mais pesquisas precisam ser conduzidas para mitigar sérios riscos à saúde dos astronautas. Um aspecto importante do ambiente espacial que impacta a fisiologia humana é a microgravidade. Aqui, um método de cultura celular foi descrito para submeter linfócitos à SMG usando um sistema de cultura de células rotativas comercialmente disponível.
Esse protocolo contém algumas etapas críticas que tal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pela Agência Espacial Canadense (CSA), bolsa de pesquisa (17ILSRA3, Immuno Profile). Os autores gostariam de reconhecer e agradecer ao Dr. Roxanne Fournier (Universidade de Toronto), ao Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) e à Preteesh Mylabathula (Universidade do Arizona) por sua ajuda com a solução inicial de problemas deste protocolo.
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
Referências
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