Культивирование лимфоцитов в условиях смоделированной микрогравитации с использованием роторной системы культивирования клеток
Summary
Это пошаговое руководство по использованию коммерчески доступной ротационной системы культивирования клеток для культивирования лимфоцитов в условиях имитации микрогравитации с использованием специализированных одноразовых сосудов для культивирования. Этот метод культивирования может быть применен к любой культуре клеток суспензионного типа.
Abstract
Учитывая текущие ограничения проведения биологических исследований в космосе, существует несколько вариантов воздействия на клеточную культуру смоделированной микрогравитации (SMG) на Земле. Эти варианты различаются по своим методам, принципам и пригодности для использования с культурой суспензионных клеток. Здесь описан метод культивирования клеток для воздействия на лимфоциты смоделированной микрогравитации с использованием коммерчески доступной ротационной системы культивирования клеток, также известной как 2D-клиностат или устройство с вращающейся стенкой (RWV). Этот метод культивирования клеток использует принцип усредненного по времени обнуления вектора гравитации для имитации микрогравитации путем вращения клеток вокруг горизонтальной оси. Клетки, культивируемые в этой системе, могут быть собраны и использованы во многих различных экспериментальных анализах для оценки влияния моделируемой микрогравитации на клеточную функцию и физиологию. Метод культивирования может незначительно варьироваться в зависимости от используемого типа клеток или линии, но описанный здесь способ может быть применен к любой культуре клеток суспензионного типа.
Introduction
Было показано, что космический полет влияет на многие аспекты физиологии человека, включая иммунную систему. Многие исследования продемонстрировали доказательства иммунной дисрегуляции в результате космического полета in vivo и воздействия моделируемой микрогравитации (SMG) in vitro1,2,3,4. Одним из основных аспектов космической среды, влияющих на физиологию человека, является микрогравитация. Микрогравитация относится к «невесомости», испытываемой из-за низких гравитационных сил в космической среде5. По мере того, как человечество готовится к более длительным космическим миссиям на Луну и Марс, необходимо провести дополнительные исследования, чтобы снизить серьезные риски для здоровья астронавтов.
Реальные условия микрогравитации для научных исследований могут быть достигнуты в космосе на борту Международной космической станции (МКС) или в наноспутниках, выводимых на орбиту; Однако эти варианты могут быть невероятно дорогостоящими и сложными в управлении. Учитывая текущие ограничения проведения биологических исследований в космосе, существует несколько вариантов индуцирования реальной микрогравитации и SMG на Земле. Существуют крупномасштабные операции, которые могут создавать короткие периоды реальной микрогравитации на Земле, включая падающие башни, параболический полет и зондирующие ракеты. Однако эти методы не слишком подходят для изучения воздействия микрогравитации на биологические системы, в основном из-за их коротких периодов обработки в условиях микрогравитации (т.е. от секунд до 20 минут). Эти методы более подробно обсуждаются в другом месте 5,6. Варианты, которые подходят для биологической культуры клеток, включают в себя небольшие устройства, такие как 2D-клиностаты или устройства с вращающимися стенками (RWV), а также 3D-клиностаты или машины случайного позиционирования (RPM). Эти устройства могут быть установлены внутри инкубаторов клеточных культур, поддерживаемых при температуре 37 °C и 5% CO2, и они вращают клеточную культуру либо по горизонтальной оси (2D), либо по двум перпендикулярным осям (3D)5. Тем не менее, важно подчеркнуть, что эти методы культивирования производят SMG в отличие от реальной микрогравитации, которая наиболее реально достигается в космосе для биологических исследований.
Цель настоящей статьи состоит в том, чтобы описать этапы воздействия на лимфоциты SMG с использованием коммерчески доступного устройства RWV (таблица материалов), которое подпадает под классификацию 2D-клиностата. Несмотря на то, что от производителя доступен общий протокол для работы с этим устройством, текущая статья направлена на более подробное рассмотрение шагов по устранению неполадок и оптимизации. В этой статье также рассматривается теория, лежащая в основе того, как это устройство работает для производства SMG в культуре суспензионных клеток, особенно с лимфоцитами. В этом контексте суспензионная клеточная культура относится к клеткам, свободно растущим в добавленных питательных средах, без прилипания к каким-либо дополнительным каркасам. Многие типы клеток выращиваются в культуре суспензионных клеток, включая лимфоциты. Лимфоциты – это клетки иммунной системы, включая Т, В и естественные клетки-киллеры (NK), которые находятся в лимфоидных органах и кровотоке7.
Описанный здесь клиностат RWV 2D работает по принципу усредненного по времени обнуления вектора гравитации 5,6,8,9, при котором вектор силы тяжести рандомизируется путем вращения культуры клеток вокруг горизонтальной оси. Это достигается путем согласования скорости вращения культивального сосуда со скоростью осаждения клеток. До тех пор, пока скорость вращения культурального сосуда хорошо согласуется со скоростью осаждения клеток, клетки находятся в свободном падении и не могут осаждаться, как это происходит в космической среде. После начальной фазы ускорения среда в сосуде для культивирования со временем достигает «вращения твердого тела». Это горизонтальное вращение также индуцирует ламинарный поток в сосуде клеточной культуры. Это создает среду «с низким сдвигом», учитывая, что напряжение сдвига, индуцированное на ячейки ламинарным потоком, намного меньше, чем у турбулентного потока. Однако, учитывая, что клиностат не является идеальной системой, вводятся небольшие движения ламинарной жидкости, которые оказывают минимальное напряжение сдвига на клетки. Таким образом, клетки, взвешенные в среде, увлекаются этим потоком во время вращения. Во время горизонтального вращения вектор силы тяжести воздействует на клетки и выводит их на колеблющуюся траекторию, как показано на рисунке 1. Другой небольшой источник напряжения сдвига вызван тем, что клетки «падают» через среду, вызывая ламинарный поток вокруг клеток. Когда культуральный сосуд вращается вокруг горизонтальной оси, вектор тяжести, испытываемый клетками, также вращается. Со временем этот вращающийся вектор гравитации в среднем приближается к нулю; это явление называется усредненным по времени обнулением вектора гравитации и индуцирует состояние SMG 5,6,8,9. Это устройство использовалось для изучения воздействия SMG на многие типы клеток, некоторые из которых описаны в ссылках10,11,12. Больше примеров можно найти на сайте производителя устройства.
В этом устройстве RWV используются специализированные «сосуды с высоким соотношением сторон» (HARV), доступные у производителя устройства. Каждый из этих HARV содержит 10 мл клеточной культуры; тем не менее, 50 мл HARV также доступны. Можно использовать либо 10 мл, либо 50 мл HARV в зависимости от того, сколько клеток необходимо для завершения любых последующих экспериментальных анализов, которые описаны далее в разделе обсуждения. HARV изготовлены из поликарбоната и включают силиконовую мембрану оксигенации, обеспечивающую газообмен во время культивирования клеток. Это поддерживает рН клеточной среды и обеспечивает эффективное клеточное дыхание. На лицевой стороне сосуда имеется основное заливное отверстие и два закрытых отверстия для шприцев (рис. 2A). После загрузки клеточной культуры через основное заливное отверстие в сосуд загружаются два шприца, чтобы помочь в удалении пузырьков. При использовании сосудов объемом 10 мл хорошо работают два шприца по 3 мл. Один шприц прикрепляется к устройству пустым, при этом шприц полностью нажат, а другой прикрепляется заполненным 3 мл клеточной культуры (рис. 2E). Они используются в комбинации для удаления пузырьков из сосуда, что важно для поддержания лечения SMG. Как правило, рекомендуется установить два отрицательных элемента управления, которые можно назвать контролем «Колба» и контролем «1G». Контроль «Колба» соответствует клеткам, которые выращиваются в стандартной колбе для культуры суспензионных клеток T25. Контроль 1G соответствует клеткам, которые выращиваются в специализированном сосуде для культивирования объемом 10 мл, который просто помещается в инкубатор (т.е. без обработки SMG). Дополнительные сведения об элементах управления см. в разделе «Обсуждение».
Описанный здесь метод подходит для любого исследователя, желающего изучить влияние SMG на лимфоциты, с особым акцентом на NK-клетки с использованием клеточной линииNK92 13. Результаты этих исследований могут помочь нам лучше понять и смягчить неблагоприятное воздействие космического полета на иммунную систему человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
По мере того, как человечество готовится к более длительным космическим миссиям на Луну и Марс, необходимо провести дополнительные исследования, чтобы снизить серьезные риски для здоровья астронавтов. Одним из основных аспектов космической среды, влияющих на физиологию человека, явля…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддержана Канадским космическим агентством (CSA), исследовательский грант (17ILSRA3, Immuno Profile). Авторы выражают признательность и благодарность доктору Роксане Фурнье (Университет Торонто), доктору Рэндалу Греггу (Мемориальный университет Линкольна) и Претишу Милабатуле (Университет Аризоны) за их помощь в первоначальном устранении неполадок этого протокола.
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
Referências
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. . The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).
- Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
- Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station – relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
- Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
- Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
- Murphy, K., Weaver, C. . Janeway’s Immunobiology 9th Edition. , (2016).
- Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
- Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
- Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
- Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
- Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
- Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022)
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022)
- Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
- Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
- Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
- Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
- Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).
