Tecnica modificata per l'uso di cuori murini neonatali nella preparazione di Langendorff

Summary

Il presente protocollo descrive la cannulazione aortica e la perfusione retrograda del cuore murino neonatale ex-vivo . Una strategia per due persone, utilizzando un microscopio di dissezione e un ago smussato di piccolo calibro, consente una cannulazione affidabile. La quantificazione della tensione contrattile longitudinale si ottiene utilizzando un trasduttore di forza collegato all’apice del ventricolo sinistro.

Abstract

L’uso del cuore perfuso retrogrado ex-vivo è stato a lungo una pietra miliare dell’indagine sull’ischemia-riperfusione sin dal suo sviluppo da parte di Oskar Langendorff oltre un secolo fa. Sebbene questa tecnica sia stata applicata ai topi negli ultimi 25 anni, il suo uso in questa specie è stato limitato agli animali adulti. Lo sviluppo di un metodo di successo per cannulare costantemente l’aorta murina neonatale consentirebbe lo studio sistematico del cuore perfuso retrogrado isolato durante un periodo critico di sviluppo cardiaco in una specie geneticamente modificabile e a basso costo. La modifica della preparazione di Langendorff consente la cannulazione e l’instaurazione della riperfusione nel cuore murino neonatale riducendo al minimo il tempo ischemico. L’ottimizzazione richiede una tecnica a due persone per consentire il successo della cannulazione dell’aorta del topo appena nato utilizzando un microscopio di dissezione e un ago modificato disponibile in commercio. L’uso di questo approccio stabilirà in modo affidabile la perfusione retrograda entro 3 minuti. Poiché la fragilità del cuore del topo neonatale e delle dimensioni della cavità ventricolare impedisce la misurazione diretta della pressione intraventricolare generata utilizzando un palloncino, è necessario l’uso di un trasduttore di forza collegato da una sutura all’apice del ventricolo sinistro per quantificare la tensione contrattile longitudinale. Questo metodo consente ai ricercatori di stabilire con successo una preparazione isolata di cuore murino neonato retrogrado perfuso a flusso costante, consentendo lo studio della biologia cardiaca dello sviluppo in modo ex-vivo . È importante sottolineare che questo modello sarà un potente strumento per studiare le risposte fisiologiche e farmacologiche all’ischemia-riperfusione nel cuore neonatale.

Introduction

I preparati cardiaci ex-vivo sono stati un punto fermo degli studi fisiologici, fisiopatologici e farmacologici per oltre un secolo. Derivando dal lavoro di Elias Cyon nel 1860, Oskar Langendorff ha adattato il modello di rana isolata per la perfusione retrograda, pressurizzando la radice aortica per fornire il flusso coronarico con un perfusato ossigenato¹. Usando il suo adattamento, Langendorff è stato in grado di dimostrare una correlazione tra circolazione coronarica e funzione meccanica². Il cuore perfuso retrogrado ex-vivo, in seguito soprannominato la tecnica Langendorff, è rimasto una pietra miliare dell’indagine fisiologica, sfruttando la sua semplicità per studiare potentemente il cuore isolato in assenza di potenziali fattori confondenti. La preparazione di Langendorff è stata ulteriormente modificata per consentire al cuore di espellere (il cosiddetto “cuore di lavoro”) e consentire al perfusato di ricircolare³. Tuttavia, gli endpoint fisiologici primari di interesse sono rimasti invariati. Tali endpoint includono misure della funzione contrattile, della conduzione elettrica, del metabolismo cardiaco e della resistenza coronarica⁴.

Per valutare la funzione cardiaca nella sua preparazione originale del cuore di rana, Langendorff ha misurato la tensione generata dalla contrazione ventricolare nell’asse longitudinale utilizzando una sutura collegata tra l’apice del cuore e un trasduttore di forza. ⁵ La contrazione isometrica è stata quantificata in questo modo con tensione basale applicata al cuore in assenza di riempimento ventricolare. Il perfezionamento dell’approccio ha portato a palloncini pieni di liquido posizionati nel ventricolo sinistro attraverso l’atrio sinistro per valutare le prestazioni miocardiche durante la contrazione isovolumica⁶. Per valutare il ritmo cardiaco e la frequenza cardiaca, i cavi superficiali possono essere posizionati sui poli del cuore per consentire agli investigatori di registrare l’elettrocardiogramma. Tuttavia, ci si può aspettare una bradicardia relativa, data la denervazione obbligatoria. La stimolazione estrinseca può servire a superare questo ed eliminare la variabilità della frequenza cardiaca tra gli esperimenti¹. Un’altra misura di esito, il metabolismo miocardico, può essere valutata misurando il contenuto di ossigeno e substrato metabolico nel perfusato coronarico e nell’effluente e calcolando la differenza tra loro⁷. La quantificazione del lattato nell’effluente coronarico può aiutare a caratterizzare i periodi di metabolismo anaerobico come si vede con ipossia, ipoperfusione, ischemia-riperfusione o perturbazioni metaboliche⁷.

Il lavoro originale di Langendorff ha permesso lo studio del cuore dei mammiferi ex-vivo, utilizzando i gatti come soggetto principale⁵. La valutazione del cuore di ratto isolato ha guadagnato popolarità a metà del 1900 con Howard Morgan, che ha dettagliato il modello di ratto “cuore funzionante” nel 1967⁵. L’uso dei topi è iniziato solo 25 anni fa a causa della complessità tecnica, della fragilità dei tessuti e delle dimensioni relativamente piccole del cuore murino. Nonostante le sfide associate allo studio sui topi, i costi inferiori e la facilità di manipolazione genetica hanno aumentato l’attrattiva e la domanda di tali preparati murini ex-vivo. Sfortunatamente, l’applicazione della tecnica è stata limitata agli animali adulti, con i topi giovani di 4 settimane che sono i soggetti più giovani utilizzati per lo studio ex-vivo fino a poco tempo fa ^8,9. Mentre i topi giovani sono “relativamente immaturi” rispetto agli adulti, la loro utilità come soggetti per gli studi di biologia dello sviluppo è limitata perché, in generale, hanno svezzato dalla loro diga di nascita e presto inizieranno la pubertà¹⁰. L’adolescenza si verifica ben oltre la transizione postnatale nell’utilizzo del substrato miocardico da glucosio e lattato agli acidi grassi¹¹. Pertanto, la maggior parte delle informazioni sui cambiamenti metabolici nel cuore neonatale è storicamente il risultato di un lavoro ex-vivo in specie più grandi come conigli e porcellini d’India¹¹.

In effetti, esistono approcci alternativi alla preparazione di Langendorff. Questi includono la sperimentazione in vitro, che manca dei dati funzionali e del contesto dell’intero organo, o studi in vivo. Questo può essere tecnicamente impegnativo e complicato confondendo variabili come gli effetti cardiovascolari e respiratori di un agente anestetico richiesto, l’influenza dell’input neuroumorale, le conseguenze della temperatura interna, lo stato nutrizionale dell’animale e la disponibilità del substrato^12,13. Poiché l’approccio di Langendorff consente lo studio del cuore isolato-perfuso in modo ex-vivo in modo più controllato in assenza di tali fattori confondenti, è stato e continua ad essere considerato un potente strumento sperimentale. Pertanto, la tecnica qui presentata offre ai ricercatori un approccio sperimentale per lo studio ex-vivo del cuore murino appena nato e limita il tempo alla riperfusione.

Studiare il cuore durante i periodi di sviluppo è una considerazione importante date le transizioni biochimiche, fisiologiche e anatomiche ad ampio raggio che si verificano durante la maturazione miocardica. I passaggi dal metabolismo anaerobico alla fosforilazione ossidativa, i cambiamenti nell’utilizzo del substrato e la progressione dalla proliferazione cellulare all’ipertrofia sono processi dinamici che si verificano in modo univoco nel cuore immaturo^11,14. Un altro aspetto critico del cuore in via di sviluppo è che i fattori di stress incontrati durante i periodi necessari possono produrre risposte intensificate nel cuore neonato e alterare la futura suscettibilità agli insulti in età adulta¹⁵. Sebbene il lavoro precedente abbia utilizzato ratti appena nati, agnelli e conigli per studiare il cuore neonatale perfuso di Langendorff, i progressi che consentono l’uso di topi sono necessari data l’importanza di questa specie per la ricerca sulla biologia dello sviluppo¹⁶. Per rispondere a questa esigenza, il primo modello murino di cuore neonato perfuso di Langendorff che utilizza animali di 10 giorni è stato recentemente istituito⁶. Qui viene presentato un metodo per consentire il successo della cannulazione aortica e stabilire la perfusione retrograda del cuore murino neonato isolato. Questo approccio può essere utilizzato per la farmacologia, l’ischemia-riperfusione o studi sul metabolismo incentrati sulla funzione dell’intero organo o può essere adattato per l’isolamento dei cardiomiociti.

Protocol

Le approvazioni del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali del Columbia University Medical Center sono state ottenute per tutti i metodi descritti. Per lo studio sono stati utilizzati topi maschi wild-type C57Bl/6 maschi del giorno 10. 1. Preparazione dell’apparato langendorff Per ridurre al minimo la complessità, utilizzare perfusato ossigenato non ricircolante all’interno dell’apparato Langendorff (vedere Tabella dei materiali) <…

Representative Results

I topi P10 sono stati utilizzati per modellare un timepoint nell’infanzia umana26,27. Quindici cuori di topo appena nati C57Bl/6 isolati sono stati raccolti e cannulati con successo. I cuori sono stati perfusi con un flusso continuo di 2,5 ml min-1 di KHB ossigenato riscaldato. Sono stati misurati i parametri metabolici, tra cui l’estrazione del glucosio, il consumo di ossigeno, la produzione di lattato e parametri fisiologici come la frequenza cardiac…

Discussion

Il presente lavoro descrive il successo della cannulazione aortica e della perfusione retrograda nel cuore isolato del topo appena nato. È importante sottolineare che consente ai ricercatori di superare le barriere che i giovani di età murina e le piccole dimensioni del cuore hanno precedentemente presentato⁸. Sebbene non sia complesso nella progettazione, l’approccio richiede un grado significativo di abilità tecnica. I passaggi chiave che inevitabilmente sfideranno anche i ricercatori tecnica…

Materials

Rodent Langendorff Apparatus	Radnoti	130102EZ
24 G catheter	BD	381511
26 G needle on 1 mL syringe combo	BD	309597
26 G steel needle	BD	305111
5-0 Silk Suture	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Circulating heating water Bath	Haake	DC10
curved iris scissor	Medline	MDS10033Z
dissecting microscope	Nikon	SMZ-2B
find spring scissors	Kent	INS600127
Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparin	Sagent	400-01
High pressure tubing	Edwards Lifesciences	50P184
iris dressing forceps	Kent	INS650915-4
Jeweler-style curved fine forceps	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Roller Pump	Gilson	Minipuls 3
straight dissecting scissors	Kent	INS600393-G
Temporary cardiac pacing wire	Ethicon	TPW30
Wide Range Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/A