Summary
בפרוטוקול זה, איי הלבלב משוחזרים ומנותחים באמצעות אלגוריתמים חישוביים המיושמים ביישום רב-תכליתי ייעודי.
Abstract
תכונות מבניות של איי הלבלב הן המפתח לתגובה התפקודית של תאים מפרישי אינסולין, גלוקגון וסומטוסטטין, בשל השלכותיהם בתקשורת תוך-תאית באמצעות איתות חשמלי, פרקרין ואוטוקרין. בפרוטוקול זה, הארכיטקטורה התלת-ממדית של איון לבלב משוחזרת תחילה מנתונים ניסיוניים באמצעות אלגוריתם חישובי חדשני. לאחר מכן, מתקבלות התכונות המורפולוגיות והקישוריותיות של האי המשוחזר, כגון המספר והאחוזים של הסוגים השונים של התאים, נפח התא והמגעים בין התא לתא. לאחר מכן, תורת הרשת משמשת לתיאור תכונות הקישוריות של האי באמצעות מדדים הנגזרים מרשת כגון תואר ממוצע, מקדם אשכולות, צפיפות, קוטר ויעילות. לבסוף, כל המאפיינים הללו מוערכים באופן פונקציונלי באמצעות סימולציות חישוביות באמצעות מודל של מתנדים מצומדים. בסך הכל, כאן אנו מתארים זרימת עבודה שלב אחר שלב, המיושמת ב- IsletLab, יישום רב-שכבתי שפותח במיוחד עבור המחקר וההדמיה של איי הלבלב, כדי ליישם מתודולוגיה חישובית חדשנית לאפיון וניתוח איי הלבלב כהשלמה לעבודה הניסויית.
Introduction
הלבלב מחולק לאזורים המכונים ראש, צוואר, גוף וזנב, שלכל אחד מהם יש מבנים, תפקודים שונים ומיקום אנטומי 1,2. מנקודת מבט פונקציונלית, ניתן לחלק את הלבלב למערכות אנדוקריניות ואקסוקריניות כאשר הראשון אחראי על הפרשת ההורמונים המעורבים באופן קריטי בוויסות ההומאוסטזיס של גלוקוז, בעוד שהאחרון תורם לעיכול מזון באמצעות הפרשת אנזימים לתוך התריסריון1. איי הלבלב מהווים את הרקמה האנדוקרינית של הלבלב והם אחראים להפרשת גלוקגון, אינסולין וסומטוסטאטין, המופרשים מתאי ɑ, β ו-δ, בהתאמה3. בנוסף למנגנוני הוויסות הפנימיים שלהם, תאים אלה מווסתים באמצעות תקשורת חשמלית ישירה (בין תאי β וככל הנראה β ותאי δ), וגם על ידי איתות פאראקרין ואוטוקרין 4,5,6. שני המנגנונים תלויים מאוד בארכיטקטורת האי (כלומר, בהרכב ובארגון של סוגי התאים השונים בתוך האי)7,8. חשוב לציין, ארכיטקטורת האיים משתנה בנוכחות סוכרת, ככל הנראה מטרידה את התקשורת התוך-תאית כתוצאה מכך 9,10.
המחקר של איי הלבלב כולל מגוון רחב של מתודולוגיות ניסיוניות. בין אלה, השימוש בטכניקות פלואורסצנטיות כדי לקבוע את מספרם, מיקומם וסוגם של התאים השונים באי אפשר לחקור את התכונות המבניות והמורפולוגיות של איי הלבלב 11,12,13 ולהבין טוב יותר את ההשלכות התפקודיות בבריאות ובמחלות. כהשלמה, מודלים חישוביים של תאי לבלב 14,15,16 ולאחרונה, איי לבלב 12,17,18,19 שימשו בעשורים האחרונים להערכת היבטים שקשה או אפילו בלתי אפשרי לטפל בהם בניסוי.
בפרוטוקול זה, אנו שואפים לגשר על הפער בין העבודה הניסיונית לעבודה החישובית על ידי התוויית מתודולוגיה לשחזור ארכיטקטורות איים, לנתח את תכונותיהן המורפולוגיות והקישוריותיות באמצעות מדדים כמותיים, ולבצע סימולציות בסיסיות כדי להעריך את ההשלכות הפונקציונליות של תכונות האיון.
הפרוטוקול המתואר להלן מבוסס על אלגוריתמים חישוביים שתוכננו במיוחד לחקר איי הלבלב. לסיכום, בשלב הראשון של הפרוטוקול, ארכיטקטורת האיים משוחזרת מנתונים ניסיוניים באמצעות האלגוריתם שהוצע לאחרונה על ידי Félix-Martínez et al.19 שבו עמדות גרעיניות המתקבלות באמצעות צביעת 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) וסוגי תאים שזוהו באמצעות אימונופלואורסצנציה (כפי שתואר בפירוט על ידי Hoang et al.11,12 ) מעובדים בהליך אופטימיזציה איטרטיבי. זה מוביל לקביעת הגודל והמיקום האופטימליים של כל תא ולקבל איון המורכב מתאים שאינם חופפים. שנית, בהתבסס על הארכיטקטורה המשוחזרת, מזוהים אנשי קשר בין תא לתא כדי לקבוע את תכונות הקישוריות וליצור את רשת האיים המתאימה המאפשרת למשתמש לקבל מדדים כמותיים כדי לתאר עוד יותר את ארכיטקטורת האיים (ניתן לעיין בפרטים על אלגוריתם השחזור בעבודה המקורית בנושא19). לבסוף, סימולציות פונקציונליות בסיסיות מבוצעות באמצעות גישת המידול שהוצעה על ידי Hoang et al.12 שבה, בהתבסס על האופי הפועם של הפרשת ההורמונים שנצפתה בניסוי 20,21, כל תא מטופל כמתנד, ולכן האי מיוצג כרשת של מתנדים מצומדים בעקבות תכונות הקישוריות של האי המשוחזר.
בהתחשב במורכבות החישובית של האלגוריתמים המשמשים בפרוטוקול זה, כל השלבים המעורבים יושמו ביישום עצמאי22 במטרה העיקרית לגשת לכל הכלים החישוביים הללו לכל הקוראים המעוניינים ללא קשר לרמת הניסיון שלהם בשימוש בתוכנות מיוחדות או בשפות תכנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: דיאגרמה סכמטית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1. תיאור שלב אחר שלב ניתן כדלקמן (ראה קובץ משלים 1 לקבלת פרטים על לוחות הבקרה המשמשים בכל שלב של הפרוטוקול).
איור 1: דיאגרמת זרימה. דיאגרמת זרימה המתארת את הסדר הרציף של הפרוטוקול כפי שהוא מיושם ב- IsletLab. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
1. התקנת IsletLab בלינוקס
הערה: בצע/י את ההוראות המופיעות בסעיפים 2 ו-3 של הקובץ המשלים 2 כדי להתקין את IsletLab בחלונות או ב-macOS.
- פתח דפדפן אינטרנט ועבור אל https://github.com/gjfelix/IsletLab. הורד וחלץ את קבצי המאגר של IsletLab.
הערה: הקובץ המשלים 3 כולל עותק של גירסת IsletLab המשמשת בפרוטוקול זה. - ודא שמהדרים gcc ו- nvcc מותקנים. פתח מסוף והקלד את הפקודות הבאות:
gcc --גרסה
nvcc --version
בצע את ההוראות המפורטות בסעיף 1 של הקובץ המשלים 2 אם אחת מפקודות אלה אינה מוכרת על-ידי המערכת. - הורד והתקן את פלטפורמת מדעי הנתונים (ראה טבלת חומרים). פתח מסוף ועבור אל התיקיה IsletLab.
- צור סביבה חדשה על-ידי הקלדת הפקודה הבאה במסוף:
conda env create -f isletlabgui_v1.0.yml - הפעל את הסביבה החדשה על-ידי הקלדה:
conda הפעל את isletlab_v1.0 - הפעל את יישום IsletLab על-ידי הקלדת הפקודה הבאה במסוף (ראה איור 2 לתיאור החלון הראשי):
פייתון isletlabgui_v1.0.py
איור 2: ממשק המשתמש של IsletLab. הממשק מורכב משלושה לוחות עיקריים: תצורה (1), סטטיסטיקה (2) וגרפיקה (3) לוחות. סרגל הכלים הגרפי (4) ממוקם בתחתית לוח הגרפיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
2. שחזור האיים
- הכן את נתוני הקלט. ארגן את נתוני אי הקלט (כלומר, סוגי תאים וקואורדינטות תלת-ממדיות (3D) בקובץ בן ארבע עמודות שבו עמודה 1 מכילה את סוג התא (מקודד כ- 11: ɑ-cell, 12: β-cell, 13: δ-cell) ועמודות 2 עד 4 מכילות את הקואורדינטות x, y ו- z, בהתאמה (ראה קטע מקובץ קלט בסעיף 5 של הקובץ המשלים 2 או קובץ בדיקת הקלט הכלול במאגר IsletLab).
- ודא שקובץ הקלט אינו כולל כותרות עמודות. השתמש בקובץ הקלט לדוגמה הכלול במאגר IsletLab כדי לעקוב אחר הפרוטוקול במידת הצורך (Input_Islet_test.txt).
הערה: נתוני קלט המשמשים לפיתוח האלגוריתמים המיושמים ב- IsletLab התקבלו באופן ניסיוני כפי שתואר בפירוט על ידי Hoang et al.11,12 באמצעות צביעת DAPI כדי לקבוע את המיקומים הגרעיניים ואת אימונופלואורסצנציה כדי לזהות את סוגי התאים. - לחץ על לחצן טען איון ראשוני ובחר את הקובץ המכיל נתוני קלט כדי ליצור איון ראשוני, ייצוג תלת-ממדי והנתונים הסטטיסטיים המתאימים. במקרה של שגיאה, תוצג ההודעה הבאה: 'שגיאה בטעינת קובץ איון'. כדי לתקן זאת, חזור על שלב 2.1.
- הגדר את תהליך השחזור. לחץ על הלחצן הגדרות שחזור ושנה את פרמטרי האופטימיזציה (ראה סעיפים 4 ו- 5 של קובץ משלים 2 לתיאור קצר של האלגוריתם והפרמטרים המוצגים בחלון הגדרות השחזור).
- הגדר את הטמפרטורה ההתחלתית = 1, גורם איטרציות = 1, וגורם קבלה = 1. לחץ על הלחצן אישור כדי לשמור את ערכי הפרמטרים.
הערה: ככלל אצבע, עלייה בפרמטר הטמפרטורה, כמו גם באיטרציות ובגורמי הקבלה, תניב תוצאות שחזור טובות יותר במונחים של תאי הניסוי הכלולים באי המשוחזר על חשבון עלייה בזמן החישוב. - לחץ על לחצן שחזר את האי כדי לפתוח את חלון יומן השחזור (ראה סעיף 6 של קובץ משלים 2 לתיאור המידע המופיע ביומן השחזור).
- לחץ על הפעל כפתור כדי להתחיל את תהליך השחזור. עקוב אחר תהליך המיטוב עד שתוצג ההודעה: 'סגור חלון זה כדי להמשיך'. סגור את חלון יומן השחזור כדי ליצור את הייצוג החזותי של האי המשוחזר ולחשב את הנתונים הסטטיסטיים הקשורים (ראו את העמודה השמאלית באיור 3A-C).
- הערך את תוצאות תהליך השחזור על ידי ניתוח סטטיסטיקות האופטימיזציה המוצגות בכרטיסיית האיים הסופית של לוח הסטטיסטיקה. במיוחד, התמקדו במקסום אחוז התאים הניסיוניים הכלולים באיים המשוחזרים (% מהניסוי) או באופן שווה ערך, במזעור מספר החפיפות (מוצג גם באופן גרפי במתווה ההתכנסות, עמודה ימנית באיור 3A-C).
- אם האחוז של הסטטיסטיקה הניסיונית נחשב נמוך בהתאם למטרות המשתמש, הפעל מחדש את IsletLab כמתואר בשלב 9.1, והעלה את הטמפרטורה הראשונית, גורם האיטרציות וגורם הקבלה בהגדרות השחזור וחזור על שלבים 2.1-2.4 עד לקבלת תוצאות משביעות רצון (> 95% מתאי הניסוי). ראו סעיפים 5-7 לתיק המשלים 2 לתיאור נוסף של תהליך השחזור והתוצאות הקשורות אליו.
3. זיהוי אנשי קשר בין תא לתא
- לחץ על הלחצן הגדרות שחזור והגדר את הפרמטר עמידות בפני איש קשר כדי להגדיר את עמידות הקשר בין התא לתא ולחץ על אישור כדי לשמור את ערכי הפרמטרים.
הערה: פרמטר סובלנות המגע מייצג את המרחק המרבי בין התאים כדי להיחשב כמגע. - לחץ על לחצן אנשי קשר מתא לתא כדי לזהות את התאים הנמצאים במגע קרוב. בכרטיסיה אנשי קשר, בדוק אם קיימים תאים במגע המוצגים באופן גרפי (קווים שחורים) בלוח הגרפיקה ובנתונים הסטטיסטיים המתאימים (כלומר, אנשי קשר כוללים, הומוטיפיים והטרוטיפיים ואנשי קשר ɑ-ɑ-ɑ, β-β, δ-δ, ɑ-β, ɑ-δ, β-δ אנשי קשר) המוצגים בחלונית הסטטיסטיקה (ראו העמודה השמאלית של איור 4A-C).
- הגדל (הקטן) את פרמטר עמידות המגע כדי להגדיל (להקטין) את מספר אנשי הקשר בין התא לתא. ראה סעיף 8 של קובץ משלים 2 לקבלת פרטים על זיהוי אנשי קשר בין תא לתא ועל התוצאות הקשורות אליו.
4. בניית רשת האיים
- לחץ על לחצן בנה רשת כדי ליצור את רשת האיים ולחשב את מדדי הרשת המשויכים (ראה העמודה הימנית באיור 4A-C).
הערה: תיאור נוסף של התוצאות הקשורות לרשת האיים שנוצרה ניתן בסעיף 9 של קובץ משלים 2.
5. סימולציה פונקציונלית של האי המשוחזר
- עבור לכרטיסיית הסימולציה של לוח התצורה של הממשק (איור 5).
- בחר את המצב הרצוי של תדר פנימי - קבוע או אקראי - ולחץ על הגדר תדר פנימי כפתור כדי להגדיר את תדרי המתנדים (ב- Hz). אם נבחר תדר פנימי אקראי, הגדר את הממוצע ואת הסטייה (ב- Hz) כדי ליצור תדרים אקראיים המתפלגים באופן נורמלי (ראה סעיף 11 של קובץ משלים 2 לתיאור הפרמטרים של הסימולציה).
- בחר את המצב הרצוי של השלב הראשוני - קבוע או אקראי. אם נבחר שלב התחלתי קבוע, לחץ על הלחצן הגדר את השלב הראשוני כדי להגדיר את הפאזה של המתנדים (ברדיאנים). אם נבחר שלב התחלתי אקראי, המערכת תקצה שלבים אקראיים בין 0 ל- 2π לכל המתנדים.
הערה: אם נבחר שלב התחלתי קבוע, כל המתנדים יאותחלו בפאזה. - לחץ על לחצן קביעת תצורה של אינטראקציות כדי להגדיר את הפרמטרים של אינטראקציה בין תא לתא בחלון חוזק האינטראקציה. לתיאור הפרמטרים של האינטראקציה, ראה סעיף 11 של קובץ משלים 2.
- הגדר את הסימולציה על-ידי הגדרת זמן הסימולציה הכולל (ב- s), שלב הזמן (ב- s) וגורם השמירה (מספרי השלבים בין נקודות הנתונים שנשמרו). בסימולציה המוצגת באיור 5 הזמן הכולל היה 20000 שניות, עם שלב זמן של 0.1 שניות ומקדם שמירה של 500 שניות.
- הגדר את מספר הבלוקים, החוטים והיכולת של פלטפורמת המחשוב הזמינים לביצוע הסימולציה. הגדר פרמטרים אלה בהתאם למאפיינים הספציפיים של יחידת העיבוד הגרפי (GPU) הזמינה.
הערה: בדוגמה המוצגת באיור 5, נעשה שימוש ב-36 בלוקים ו-64 הליכי משנה לכל בלוק (2304 ליבות של פלטפורמת מחשוב) מאז שנעשה שימוש במעבד גרפי עם 36 מעבדים מרובים ו-64 ליבות של פלטפורמת מחשוב לכל מעבד מרובה מעבדים. הערך של פרמטר יכולת פלטפורמת המחשוב בו נעשה שימוש היה 75 מכיוון שיכולת פלטפורמת המחשוב בחומרה הייתה 7.5 (ראה סעיף 10 של קובץ משלים 2 לפרטים על פרמטרים אלה). - לחץ על לחצן הפעל סימולציה כדי לפתוח את חלון יומן הסימולציה. לחץ על הפעל כפתור כדי להתחיל את הסימולציה ולנטר את התהליך עד להצגת המקרא: 'אנא סגור את החלון כדי להמשיך'. ראה סעיף 12 של קובץ משלים 2 לקבלת פרטים על יומן הסימולציה.
- סגור את חלון יומן הסימולציה כדי לצפות בתוצאות הסימולציה (ראו איור 5). פרטים על תוצאות הסימולציה מובאים בסעיף 13 לתיק משלים 2.
6. שמור את הפרויקט (אופציונלי)
- לחץ על קובץ > ייצוא פרוייקט בשורת התפריטים. בחר את הספריה שבה יישמר קובץ הפרוייקט ולחץ על הלחצן אישור .
הערה: שם קובץ הפרוייקט נקבע באופן אוטומטי בהתבסס על שם קובץ הנתונים הראשוני. אם הפרוייקט לא נשמר, כל התוצאות והקבצים הקשורים יימחקו באופן אוטומטי. - טען פרוייקט מיוצא על-ידי לחיצה על קובץ > טען פרוייקט.
7. שמירת נתונים (אופציונלי)
- לחץ על סמל שמור עלילה הממוקם בסרגל הכלים של העלילה כדי לשמור את התצוגה החזותית הנוכחית בקובץ תמונה. חזור על שלב זה עבור כל הדמויות שנוצרו לאורך הפרוטוקול.
הערה: ניתן לשנות עלילות ותצוגות חזותיות של איון באמצעות הסמלים הזמינים בסרגל הכלים של העלילה של החלונית הגרפית.
8. טען פרויקט (אופציונלי)
- לחץ על קובץ > טען פרוייקט בתפריט הראשי ובחר קובץ פרוייקט שנשמר קודם לכן כמתואר בשלבים 6.1-6.2.
הערה: פרוייקט לא ייטען כראוי אם קובץ הפרוייקט השתנה באופן חיצוני. אם פרויקט נטען בהצלחה, רק יכולות הסימולציה יהיו זמינות.
9. הפעל מחדש את תהליך השחזור והניתוח (אופציונלי)
- בכל עת המשתמש יכול לבחור קובץ > הפעלה מחדש כדי למחוק את כל התוצאות ולהתחיל שחזור וניתוח חדשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השחזור של איי הלבלב באמצעות המתודולוגיה המוצעת על ידי Félix-Martínez et al.19 תלוי מאוד בפרמטרים שניתנו לאלגוריתם האופטימיזציה (המוגדר בהגדרות השחזור). דוגמה לכך מוצגת באופן חזותי באיור 3, שם מוצגים איונים משוחזרים המתקבלים באמצעות קבוצות שונות של פרמטרים. ראשית, באיור 3A מוצג שחזור שכלל 86.6% מהתאים שנכללו בנתונים הראשוניים (509 מתוך 588 תאים, טמפרטורה התחלתית = 1, גורם איטרציות = 1, גורם קבלה = 1). כאשר הטמפרטורה ההתחלתית וגורמי האיטרציה והקבלה מוגברים (הטמפרטורה ההתחלתית = 10, גורם האיטרציות = 5, ומקדם הקבלה = 5, איור 3B), אחוז גבוה יותר (93.37%) מהתאים ההתחלתיים נכללו באיים המשוחזרים (כלומר, 549 מתוך 588 תאים). ניתן להשיג תוצאות טובות עוד יותר אם משתמשים בערכים גבוהים בהרבה, במיוחד עבור גורמי האיטרציה והקבלה, כפי שמודגם באיור 3C (טמפרטורה התחלתית = 10, גורם איטרציות = 1000, גורם קבלה = 500), כאשר האי המשוחזר מורכב מ-99.15% מהתאים ההתחלתיים (583 מתוך 588 תאים). יש להעריך את חלקות ההתכנסות (העמודה הימנית באיור 3A-C), המציגות את האבולוציה של תאים חופפים כפונקציה של הטמפרטורה, כדי לקבוע כיצד הפרמטרים משפיעים על תהליך האופטימיזציה. ככלל אצבע, יש להגדיל את גורמי האינטראקציה והקבלה כאשר האי המשוחזר כולל אחוז נמוך של תאים ראשוניים. כתוצאה מכך, זמן המחשוב יגדל בהכרח, שכן גורמים אלה מגדילים ישירות את מספר האיטרציות המוערך. לדוגמה, זמן החישוב של השחזור הראשון שתואר לעיל היה 6 שניות. לעומת זאת, זמני המחשוב של השחזורים השני והשלישי היו 21 שניות ו-24 דקות 6 שניות, בהתאמה.
איור 3: שחזור איים באמצעות קבוצות תת-אופטימליות של פרמטרים בהגדרות השחזור שימוש בקבוצות תת-אופטימליות של פרמטרים עלול להוביל לאחוז נמוך של תאי ניסוי באיים המשוחזרים. (A) משמאל: 86.6% מתאי הניסוי נכללו באי המשוחזר (טמפרטורה התחלתית = 1, גורם איטרציות = 1, גורם קבלה = 1, זמן חישוב = 6 שניות). מימין: תרשים התכנסות של תהליך השחזור. (B) משמאל: 93.4% מתאי הניסוי נכללו באי המשוחזר (טמפרטורה התחלתית = 10, גורם איטרציות = 10, גורם קבלה = 5, זמן חישוב = 21 שניות). מימין: תרשים התכנסות של תהליך השחזור. (C) משמאל: 99.15% מתאי הניסוי נכללו באי המשוחזר (טמפרטורה התחלתית = 10, גורם איטרציות = 1000, גורם קבלה = 500, זמן חישוב = 24 דקות, 8 שניות). מימין: תרשים התכנסות של תהליך השחזור. החצים בחלקות ההתכנסות מציינים את התאים החופפים הראשוניים והסופיים של תהליך השחזור (לפני שלב העיבוד שלאחר העיבוד של אלגוריתם השחזור). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
זיהוי המגעים בין התא לתא מהאי המשוחזר תלוי בערך של פרמטר סובלנות המגע (המוגדר בהגדרות השחזור) כפי שמודגם באיור 4A-C, שם מוצגים המגעים בין התא לתא (המיוצגים על-ידי קווים שחורים), שזוהו מהארכיטקטורות המשוחזרות המוצגות באיור 3A-C. לדוגמה, אם מוגדרת סבילות מגע של 1 מיקרומטר, כמו באיור 4A, רק 290 אנשי קשר בין תא לתא מזוהים. לעומת זאת, אם סבילות המגעים מוגברת ל-2 מיקרומטר, כמו באיור 4B,C, סך המגעים שזוהו עלה ל-636 ול-731, בהתאמה (ראו את לוח הסטטיסטיקה באיור 4A-C). ניתן להבחין בהבדלים אלה גם בייצוג החזותי של המגעים בין התא לתא המוצגים בעמודה השמאלית של איור 4A-C, מכיוון שמספר המגעים בין התאים גדל בבירור ככל שנעשה שימוש בערך גבוה יותר של עמידות המגע. ראוי להדגיש כי מספר המגעים תלוי גם במספר התאים הכלולים באיים המשוחזרים, ולכן, השילוב של פרמטר הטמפרטורה, איטרציות וגורמי קבלה, וסובלנות מגע קובעים בסופו של דבר את הקישוריות של האי המשוחזר, אשר משתקף ברשתות האיים שנוצרו ובמדדי הרשת המתאימים, כפי שמוצג בעמודה הימנית של איור 4A-C. תרשים הרשת מאפשר למשתמש להמחיש כיצד התאים השונים מחוברים. מבחינה כמותית, מאפייני הקישוריות של האיון מתוארים במונחים של מדדי הרשת הבאים: מעלה ממוצעת, צפיפות, מקדם אשכולות ממוצע, נצילות וקוטר (ניתן לעיין בפרטים על מדדים אלה בסעיף 9 של הקובץ המשלים 2).
איור 4: ההשפעה של פרמטר סובלנות המגע בזיהוי מגעים בין תא לתא. (A-C) משמאל: אנשי קשר בין תא לתא שזוהו מהאיים המשוחזרים המוצגים באיור 3A-C (290, 636 ו-731 מגעים כוללים בפאנלים A, B ו-C, בהתאמה). הערכים ששימשו לפרמטר סובלנות המגע היו 1 מיקרומטר (A) ו-2 מיקרומטר (B ו-C). שים לב שמספר התאים הכלולים באיים המשוחזרים משפיע גם על מספר המגעים בין התא לתא שזוהו. מימין: רשתות שנוצרו מאנשי הקשר בין התא לתא מוצגות בעמודה השמאלית המתאימה. שים לב שהשפעת הקישוריות על מדדי הרשת מודגשת בלוח הסטטיסטיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
לבסוף, לאחר שהאיון שוחזר וזוהו המגעים בין התא לתא, ניתן לבצע סימולציה פונקציונלית (רק כאשר GPU תואם זמין). תוצאות סימולציה אופייניות מוצגות באיור 5, כולל התנודות המסוכמות של אוכלוסיות התאים השונות (ɑ, β ותאי δ) ושל האי כולו (החלק העליון של לוח הגרפיקה באיור 5). איור זה מציג את הבדלי הפאזה לאורך זמן בין אוכלוסיות התאים השונות כתוצאה מתכונות הקישוריות והאינטראקציה ומאפשר למשתמש לקבוע את התרומה של כל אוכלוסיית תאים (קווים אדומים, ירוקים וכחולים) להתנהגות המתנודדת של האי כולו (קו שחור). לדוגמה, הלוח העליון של איור 5 מציע כי ברמת האוכלוסייה, תאי ɑ ו-β מתנדנדים לחלוטין מחוץ לפאזה, בעוד שתאי δ מתנדנדים מחוץ לפאזה עם תאי ɑ ו-β. יתר על כן, על פי הסימולציה, ההתנהגות המתנודדת של האי נשלטת על ידי התנודות של תאי ɑ, אם כי ניתן להבחין גם בהשפעה של אוכלוסיות התאים האחרות. שים לב שאותות המתנדנדים של כל תאי האיון נשמרים באופן אוטומטי בקובץ נתונים (ראה טבלה 1 וסעיף 13 בקובץ משלים 2), ובכך מאפשרים למשתמש לבצע ניתוח מפורט של תוצאות הסימולציה. כהשלמה, מדד סנכרון האיים, המשקף את קוהרנטיות הפאזה של התנודות, מחושב ומוצג גם הוא (החלק התחתון של לוח הגרפיקה באיור 5). שים לב שמדד הסינכרון נע בין 0 ל- 1, כאשר 0 ו- 1 מציינים סינכרון ריק וסינכרון כולל בין כל התאים באיון, בהתאמה. לפיכך, ניתן לפרש את תרשים אינדקס הסינכרון כהדמיה של האופן שבו הסינכרוניות בין תאי האי משתנה עם הזמן כתוצאה מתכונות הקישוריות והאינטראקציה של האי המשוחזר. מכיוון שהסימולציה המבוצעת מבוססת על הרעיון של מתנדים מצומדים12 ותלויה במידה רבה בקישוריות של האי המשוחזר, המפתח הוא להגיע לשחזור איון מקובל וקישוריות מתא לתא לפני ביצוע סימולציה פונקציונלית.
איור 5: פרמטרי הסימולציה מוגדרים בלוח התצורה של לשונית הסימולציה. תוצאות הסימולציה מוצגות בכרטיסיית הסימולציה של לוח הגרפיקה, שם מוצגת ההתנהגות המתנודדת המסוכמת של אוכלוסיות התאים השונות (ɑ, β ו-δ) ושל האי כולו (למעלה). מדד הסינכרון, מדד לקוהרנטיות פאזה בין תאי האיון, מוצג גם הוא (למטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
ראוי להזכיר כי כמעט בכל שלב של התהליך, קבצי נתונים נוצרים. תיאור של קבצי הנתונים שנוצרו ניתן למצוא בטבלה 1 ובקובץ משלים 2.
| קובץ | תיאור |
| IsletFileName | נתוני קלט (ניתנים על-ידי המשתמש) |
| IsletFileName_initial.txt | ארכיטקטורת איון ראשונית שהוצעה על ידי האלגוריתם כשלב ראשוני של השחזור |
| IsletFileName_reconstructed.txt | איון משוחזר (לא פוזה) |
| IsletFileName_postprocessed_islet.txt | איון משוחזר סופי ואיון משוחזר |
| IsletFileName_processlog.txt | יומן שחזור (אלגוריתם אופטימיזציה) |
| IsletFileName_overlapped_cells.txt | תאים חופפים בסוף תהליך השחזור (לאחר העיבוד) |
| IsletFileName_all_contacts.txt | מטריצת אדג'ננסיות של כל אנשי הקשר |
| IsletFileName_aa_contacts.txt | מטריצת Adjancency של אנשי קשר ɑ-ɑ |
| IsletFileName_ab_contacts.txt | מטריצת Adjancency של אנשי קשר ɑ-β |
| IsletFileName_ad_contacts.txt | מטריצת אדג'ננסיות של אנשי קשר ɑ-δ |
| IsletFileName_bbbd_contacts.txt | מטריצת אדג'ננסיות של אנשי קשר β-β ו-β-δ |
| IsletFileName_bb_contacts.txt | מטריצת אדג'נסיות של אנשי קשר β-β |
| IsletFileName_bd_contacts.txt | מטריצת אדיקות של אנשי קשר β-δ |
| IsletFileName_dd_contacts.txt | מטריצת אדג'ננסי של אנשי קשר δ-δ |
| IsletFileName_Kmat.txt | מטריצת אינטראקציה המשמשת בסימולציה |
| IsletFileName_kuramoto_angles.txt | תוצאות סימולציית קוראמוטו |
טבלה 1: תיאור של קבצים שנשמרו כחלק מקובץ הפרוייקט. שים לב ששם הקובץ המשמש לשמירת קבצי הפרוייקט מוגדר באופן אוטומטי על-ידי קובץ הנתונים הראשוני שנבחר על-ידי המשתמש.
קובץ משלים 1: תיאור גרפי של הפרוטוקול באמצעות לוחות הבקרה של IsletLab. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: תיעוד IsletLab. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 3: כולל את כל הקבצים הדרושים להתקנת IsletLab. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הנ"ל מתווה גישה מעשית לשחזור וניתוח ארכיטקטורות איון הלבלב באמצעות אלגוריתמים חישוביים חדשניים. המטרה העיקרית של עבודה זו היא לאפשר לקהילת המחקר של האיים לגזור מדדים כמותיים כדי לאפיין את התכונות המורפולוגיות והקישוריות של ארכיטקטורות איון הלבלב ולהעריך את ההשלכות הפונקציונליות האפשריות של תכונות כאלה באמצעות סימולציות חישוביות.
בעוד שהאלגוריתמים שאומצו בפרוטוקול זה תוארו בעבר בפירוט12,19, יישום ישיר וידידותי למשתמש היה חסר בשל המורכבות היחסית שלהם, ובכך הגביל את השימוש בהם ככלי משלים לעבודה הניסויית והתיאורטית.
ראשית, אלגוריתם שהוצע לאחרונה על ידי Félix-Martínez et al.19 משמש לשחזור ארכיטקטורות האיים מנתונים ניסיוניים (למשל, קואורדינטות גרעיניות וסוג התא). כתוצאה מכך, המשתמש מקבל ארכיטקטורת איון המורכבת מתאים כדוריים שאינם חופפים עם רדי המוקצה באופן אוטומטי בהתאם להתפלגויות הניסוי המדווחות. בפועל, אלגוריתם השחזור הוא הליך אופטימיזציה איטרטיבי שהופך ליקר מבחינה חישובית ככל שמספר התאים באיון גדל. מסיבה זו, מומלץ מאוד להשתמש במערכת מרובת מעבדים כדי לנצל את יישום העיבוד המקבילי של האלגוריתם המתואר בפרוטוקול זה. כפי שתואר לעיל, שלב מפתח לתהליך השחזור הוא הגדרת ערכים מתאימים עבור הפרמטרים המעורבים (כלומר, איטרציות, גורמי קבלה וטמפרטורה התחלתית), שכן זמן המחשוב יהיה קשור ישירות למספר האיטרציות שבוצעו, בנוסף למספר התהליכים המקביליים שבהם נעשה שימוש (כלומר, פרמטר החוטים בהגדרות השחזור). אם זמן המחשוב אינו מהווה בעיה, אנו ממליצים בחום להשתמש בערכים הגבוהים ביותר האפשריים עבור האיטרציות וגורמי הקבלה על מנת להגדיל את מספר האיטרציות המבוצעות.
השלבים הבאים של הפרוטוקול הם זיהוי אנשי קשר בין תא לתא ויצירת רשת האיים. שני השלבים קשורים ישירות לתהליך השחזור וככאלה, מספר התאים הכלולים באיים המשוחזרים (ולכן הפרמטרים המעורבים), כמו גם הערך של סובלנות המגע המשמשת, הוא המפתח להשגת התוצאות הטובות ביותר האפשריות.
לבסוף, אם תרצה המשתמש, ניתן לבצע סימולציות פונקציונליות באמצעות יישום המודל של מתנדים מצומדים המוצעים על ידי Hoang et al.12 באמצעות רשת הקישוריות הנגזרת מתהליך השחזור כדי להגדיר את המערכת המתנודדת. בהתחשב בכך שתהליך הסימולציה כרוך בפתרון מערכת של מאות או אלפי משוואות דיפרנציאליות מצומדות (אחת לכל תא באיון), אלגוריתם הסימולציה יושם תוך ניצול האפשרות לבצע חישובים מקביליים באמצעות ה-GPU, ובכך לאפשר למשתמש לדמות סימולציות ארוכות ניכרות בזמן מחשוב קצר יחסית. שלבים מרכזיים בשלב הסימולציה של הפרוטוקול הם לקבוע את המספר המתאים של בלוקים וחוטים הזמינים במקטע הגדרות פלטפורמת המחשוב בלוח הסימולציה, היבט הקשור ישירות למאפייני החומרה בה נעשה שימוש. שאר הפרמטרים המעורבים (תדירות פנימית, פאזה ראשונית וחוזקות אינטראקציה בלוח הסימולציה), למרות שהם רלוונטיים לתוצאות הסימולציה, קשורים בעיקר לבעיה הנחקרת ועליהם להיות מוגדרים על ידי המשתמש לאחר מחשבה מעמיקה על מנת לייצג את תרחיש הסימולציה הרצוי.
למרות היתרונות שמציע הפרוטוקול, יש להכיר במגבלות מסוימות. ראשית, הפרמטרים הקשורים לתהליך השחזור ולזיהוי המגעים בין התא לתא אינם ייחודיים ועשויים להשתנות ממקרה למקרה. מסיבה זו, למרות שניתן להשתמש בכלל אצבע כדי לקבוע את הערך של הפרמטרים הנדרשים, גישה של ניסוי וטעייה היא עדיין בלתי נמנעת. היבט נוסף שיכול להגביל את תחולת הפרוטוקול הוא המשאבים החישוביים הדרושים, במיוחד עבור שלבי השחזור וההדמיה של הפרוטוקול. למרות מגבלות אלה, העובדה שאין צורך בידע בתכנות ליישום הפרוטוקול מאפשרת לחוקרים מרקעים מגוונים לעשות שימוש בקלות באלגוריתמים המוצעים שאחרת היו נשארים מעורפלים עבור המשתמש שאינו מתמחה.
שימושים פוטנציאליים בפרוטוקול המוצע כוללים הדמיה של נתונים ניסיוניים, ניתוח השוואתי של איים רגילים ומשתנים (למשל, בנוכחות סוכרת מסוג 1 או 2), או אפילו השוואה בין איים ממינים שונים באמצעות מדדים מורפולוגיים כמותיים, מבניים ומבוססי רשת23. יתר על כן, איים משוחזרים המשתמשים בפרוטוקול המתואר כאן יכולים לשמש בקלות ליצירת מודלים מתמטיים פונקציונליים מפורטים שבהם הקישוריות וגדלי התאים שנקבעו על ידי אלגוריתם השחזור משלימים מודלים אלקטרופיזיולוגיים מפורטים של תאי הלבלב כדי להבהיר את ההשלכות התפקודיות של התקשורת הבין-תאית בתוך איים משוחזרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
G.J. Félix-Martínez מודה ל- CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México) ולמחלקה להנדסת חשמל של אוניברסיטת אוטונומה מטרופוליטנה (México City) על התמיכה שניתנה לפרויקט זה. אנו מודים לד"ר דאן-טאי הואנג, לד"ר מנאמי הארה ולד"ר ג'ונגיו ג'ו על עבודתם יוצאת הדופן ונדיבותם בשיתוף ארכיטקטורות האיים שאפשרו עבודה זו עם קהילת המחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUDA-capable NVIDIA graphics card | Required for the functional simulations | ||
| IsletLab | https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.) |
References
- Chen, L., Pan, X., Zhang, Y. H., Huang, T., Cai, Y. D. Analysis of Gene Expression Differences between Different Pancreatic Cells. ACS Omega. 4 (4), 6421-6435 (2019).
- Longnecker, D. S., Gorelick, F., Thompson, E. D., Histology, Anatomy, Histology, and Fine Structure of the Pancreas. The Pancreas. Beger, H. G., Warshaw, A. L., Hruban, R. H., Buchler, M. W., Lerch, M. M., Neoptolemos, J. P., Shimosegawa, T., Whitcomb, D. C., GroB, C. , Wiley Online Library. (2018).
- Liao, E. P., Brass, B., Abelev, Z., Poretsky, L. Endocrine Pancreas. Principles of Diabetes Mellitus. Poretsky, L. , Springer. Cham. (2017).
- Noguchi, G. M., Huising, M. O. Integrating the inputs that shape pancreatic islet hormone release. Nature Metabolism. 1, 1189-1201 (2019).
- Pérez-Armendariz, E. M. Connexin 36, a key element in pancreatic beta cell function. Neuropharmacology. 75, 557-566 (2013).
- Briant, L., et al. δ-cells and β-cells are electrically coupled and regulate α-cell activity via somatostatin. The Journal of Physiology. 596 (2), 197-215 (2018).
- Arrojoe Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Folli, F., et al. Pancreatic islet of Langerhans' cytoarchitecture and ultrastructure in normal glucose tolerance and in type 2 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 20, Suppl 2 137-144 (2018).
- Kilimnik, G., et al. Altered islet composition and disproportionate loss of large islets in patients with type 2 diabetes. PloS One. 6 (11), 27445 (2011).
- Hoang, D. T., et al. A Conserved Rule for Pancreatic Islet Organization. PloS One. 9 (10), 110384 (2014).
- Hoang, D. T., Hara, M., Jo, J. Design Principles of Pancreatic Islets: Glucose-Dependent Coordination of Hormone Pulses. PloS One. 11 (4), 0152446 (2016).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Félix-Martinez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Mathematical models of electrical activity of the pancreatic β-cell: a physiological review. Islets. 6 (3), 949195 (2014).
- Félix-Martínez, G. J., González-Vélez, V., Godínez-Fernández, J. R., Gil, A. Electrophysiological models of the human pancreatic δ-cell: From single channels to the firing of action potentials. International Journal for Numerical Methods in Biomedical Engineering. 36 (2), 3296 (2020).
- Watts, M., Sherman, A. Modeling the pancreatic α-cell: dual mechanisms of glucose suppression of glucagon secretion. Biophysical Journal. 106 (3), 741-751 (2014).
- Lei, C. L., et al. Beta-cell hubs maintain Ca2+ oscillations in human and mouse islet simulations. Islets. 10 (4), 151-167 (2018).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 310 (8), 597-611 (2016).
- Félix-Martínez, G. J., Mata, A., Godínez-Fernández, J. R. Reconstructing human pancreatic islet architectures using computational optimization. Islets. 12 (6), 121-133 (2020).
- Hellman, B., Salehi, A., Gylfe, E., Dansk, H., Grapengiesser, E. Glucose generates coincident insulin and somatostatin pulses and antisynchronous glucagon pulses from human pancreatic islets. Endocrinology. 150 (12), 5334-5340 (2009).
- Hellman, B., Salehi, A., Grapengiesser, E., Gylfe, E. Isolated mouse islets respond to glucose with an initial peak of glucagon release followed by pulses of insulin and somatostatin in antisynchrony with glucagon. Biochemical and Biophysical Research Communications. 417 (4), 1219-1223 (2012).
- Félix-Martínez, G. J. IsletLab: an application to reconstruct and analyze islet architectures. Islets. 14 (1), 36-39 (2022).
- Félix-Martínez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Comparative analysis of reconstructed architectures from mice and human islets. Islets. 14 (1), 23-35 (2022).
