Samtidig visualisering av dynamikken i krysskoblede og enkle mikrotubuler in vitro av TIRF mikroskopi
Summary
Her presenteres en TIRF-mikroskopibasert in vitro rekonstitueringsanalyse for samtidig å kvantifisere og sammenligne dynamikken i to mikrotubulpopulasjoner. En metode er beskrevet for samtidig å se den kollektive aktiviteten til flere mikrotubule-assosierte proteiner på krysskoblede mikrotubulbunter og enkle mikrotubuler.
Abstract
Mikrotubuler er polymerer av αβ-tubulin heterodimers som organiserer seg i forskjellige strukturer i celler. Mikrotubulebaserte arkitekturer og nettverk inneholder ofte delsett av mikrotubule-matriser som er forskjellige i deres dynamiske egenskaper. For eksempel, i å dele celler, sameksisterer stabile bunter av krysskoblede mikrotubuler i nærheten av dynamiske ikke-krysskoblede mikrotubuler. TIRF-mikroskopibaserte in vitro rekonstitueringsstudier muliggjør samtidig visualisering av dynamikken i disse forskjellige mikrotubule arrayene. I denne analysen er et bildekammer montert med overflate-immobiliserte mikrotubuler, som enten er til stede som enkeltfilamenter eller organisert i krysskoblede bunter. Innføring av tubulin-, nukleotider og proteinregulatorer tillater direkte visualisering av tilknyttede proteiner og av dynamiske egenskaper av enkle og krysskoblede mikrotubuler. Videre kan endringer som skjer som dynamiske enkeltmikrotubuler organiseres i bunter overvåkes i sanntid. Metoden beskrevet her tillater en systematisk evaluering av aktiviteten og lokaliseringen av individuelle proteiner, samt synergistiske effekter av proteinregulatorer på to forskjellige mikrotubule-delsett under identiske eksperimentelle forhold, og gir dermed mekanistisk innsikt som er utilgjengelig ved andre metoder.
Introduction
Mikrotubuler er biopolymerer som danner strukturelle stillaser som er avgjørende for flere cellulære prosesser, alt fra intracellulær transport og organellposisjonering til celledeling og forlengelse. For å utføre disse forskjellige funksjonene, er individuelle mikrotubuler organisert i mikron-størrelse arrays, for eksempel mitotiske spindler, ciliary axonemes, nevronale bunter, interfase arrays og plante kortikale arrayer. Et allestedsnærværende arkitektonisk motiv som finnes i disse strukturene er en bunt mikrotubuler krysset langs lengdene1. Et spennende trekk ved flere mikrotubulebaserte strukturer er sameksistensen av buntede mikrotubuler og ikke-krysskoblede enkeltmikrotubuler i nær romlig nærhet. Disse mikrotubule subpopulations kan vise sterkt forskjellig polymerisasjonsdynamikk fra hverandre, etter behov for riktig funksjon2,3,4,5. For eksempel, innenfor den mitotiske spindelen, er stabile krysskoblede bunter og dynamiske enkeltmikrotubuler til stede i et mikronskalaområde ved cellesenteret6. Å studere hvordan de dynamiske egenskapene til sameksistens mikrotubulpopulasjoner er spesifisert, er derfor sentralt for å forstå montering og funksjon av mikrotubulebaserte strukturer.
Mikrotubuler er dynamiske polymerer som veksler mellom faser av polymerisasjon og depolymerisering, og bytter mellom de to fasene i hendelser kjent som katastrofe og redning7. Dynamikken i cellulære mikrotubuler er regulert av myriade Microtubule Associated Proteins (MAPs) som modulerer frekvensen av mikrotubul polymerisering og depolymerisering og frekvensene av katastrofe- og redningshendelser. Det er utfordrende å undersøke maps aktivitet på romlig proksimale arrayer i celler, på grunn av begrensningene i romlig oppløsning i lysmikroskopi, spesielt i områder med høy mikrotubul tetthet. Videre hindrer tilstedeværelsen av flere MAPer i samme cellulære region tolkninger av cellebiologiske studier. In vitro rekonstitueringsanalyser, utført i forbindelse med TOTAL Internal Reflection Fluorescence (TIRF) mikroskopi, omgår utfordringene med å undersøke mekanismer der spesifikke undergrupper av MAPer regulerer dynamikken i proksimale cellulære mikrotubule arrayer. Her undersøkes dynamikken i mikrotubuler samlet in vitro i nærvær av en eller flere rekombinante MAPer under kontrollerte forhold8,9,10. Konvensjonelle rekonstitueringsanalyser utføres imidlertid vanligvis på enkle mikrotubuler eller på en type matrise, noe som utelukker visualiseringen av samtidige populasjoner.
Her presenterer vi in vitro rekonstitueringsanalyser som muliggjør samtidig visualisering av to mikrotubulpopulasjoner under de samme løsningsbetingelsene11. Vi beskriver en metode for samtidig å se den kollektive aktiviteten til flere MAPer på enkeltmikrotubuler og på mikrotubulbunter krysskoblet av det mititotiske spindel-assosierte proteinet PRC1. Proteinet PRC1 binder seg fortrinnsvis ved overlappingen mellom anti-parallelle mikrotubuler, krysskobler dem9. Kort sagt består denne protokollen av følgende trinn: (i) fremstilling av lagerløsninger og reagenser, (ii) rengjøring og overflatebehandling av deksler som brukes til å lage bildekammeret for mikroskopiforsøk, (iii) fremstilling av stabile mikrotubule “frø” hvorfra polymerisasjon initieres under eksperimentet, (iv) spesifikasjon av TIRF mikroskopinnstillinger for å visualisere mikrotubuldynamikk, (v) immobilisering av mikrotubule frø og generering av krysskoblede mikrotubule bunter i bildekammeret, og (vi) visualisering av mikrotubuldynamikk i bildekammeret gjennom TIRF-mikroskopi, ved tilsetning av løselig tubulin, MAPer og nukleotider. Disse analysene muliggjør kvalitativ evaluering og kvantitativ undersøkelse av MAP lokalisering og deres effekt på dynamikken i to mikrotubule populasjoner. I tillegg legger de til rette for evaluering av synergistiske effekter av flere MAPer på disse mikrotubule populasjonene, på tvers av et bredt spekter av eksperimentelle forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eksperimentet beskrevet her utvider omfanget og kompleksiteten til konvensjonelle mikrotubul rekonstitueringsanalyser, som tradisjonelt utføres på enkeltmikrotubuler eller på en type array. Den nåværende analysen gir en metode for samtidig å kvantifisere og sammenligne den regulatoriske MAP-aktiviteten på to populasjoner, nemlig enkle mikrotubuler og krysskoblede bunter. Videre tillater denne analysen undersøkelse av to typer bunter: de som er forhåndsformet fra stabile frø før oppstart av dynamikk, og de som …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH (nr. 1DP2GM126894-01), og av midler fra Pew Charitable Trusts og Smith Family Foundation til R.S. Forfatterne takker Dr. Shuo Jiang for hans bidrag til utvikling og optimalisering av protokollene.
Materials
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18×18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24×60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 | |
Referências
- Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
- Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape. Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).
- Foe, V. E., von Dassow, G. Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation. The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).
- Pous, C., et al. Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells. The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).
- Uehara, R., Goshima, G. Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase. The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
- Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module. Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Wijeratne, S., Subramanian, R. Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A. eLife. 7, 32595 (2018).
- Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization. eLife. 10, 63880 (2021).
- Freal, A., et al. Feedback-driven assembly of the axon initial segment. Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).
- Ledbetter, M., Porter, K. A "microtubule" in plant cell fine structure. The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).
- Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).
