Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie
Summary
Hier wird ein TIRF-Mikroskopie-basierter In-vitro-Rekonstitutionsassay vorgestellt, um gleichzeitig die Dynamik zweier Mikrotubulipopulationen zu quantifizieren und zu vergleichen. Es wird ein Verfahren beschrieben, um gleichzeitig die kollektive Aktivität mehrerer Mikrotubuli-assoziierter Proteine auf vernetzten Mikrotubulibündeln und einzelnen Mikrotubuli zu betrachten.
Abstract
Mikrotubuli sind Polymere von αβ-Tubulin-Heterodimeren, die sich in Zellen zu unterschiedlichen Strukturen organisieren. Mikrotubuli-basierte Architekturen und Netzwerke enthalten häufig Teilmengen von Mikrotubuli-Arrays, die sich in ihren dynamischen Eigenschaften unterscheiden. Zum Beispiel koexistieren in sich teilenden Zellen stabile Bündel vernetzter Mikrotubuli in unmittelbarer Nähe zu dynamischen, nicht vernetzten Mikrotubuli. TIRF-mikroskopiebasierte In-vitro-Rekonstitutionsstudien ermöglichen die gleichzeitige Visualisierung der Dynamik dieser verschiedenen Mikrotubuli-Arrays. Bei diesem Assay wird eine Bildgebungskammer mit oberflächenimmobilisierten Mikrotubuli zusammengesetzt, die entweder als einzelne Filamente vorliegen oder in vernetzten Bündeln organisiert sind. Die Einführung von Tubulin, Nukleotiden und Proteinregulatoren ermöglicht die direkte Visualisierung von assoziierten Proteinen und von dynamischen Eigenschaften einzelner und vernetzter Mikrotubuli. Darüber hinaus können Änderungen, die auftreten, wenn sich dynamische einzelne Mikrotubuli zu Bündeln organisieren, in Echtzeit überwacht werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine systematische Bewertung der Aktivität und Lokalisation einzelner Proteine sowie synergistischer Effekte von Proteinregulatoren auf zwei verschiedene Mikrotubuli-Untergruppen unter identischen experimentellen Bedingungen und liefert dadurch mechanistische Erkenntnisse, die mit anderen Methoden nicht zugänglich sind.
Introduction
Mikrotubuli sind Biopolymere, die strukturelle Gerüste bilden, die für mehrere zelluläre Prozesse unerlässlich sind, vom intrazellulären Transport und der Organellenpositionierung bis hin zur Zellteilung und -dehnung. Um diese vielfältigen Funktionen auszuführen, sind einzelne Mikrotubuli in mikrometergroße Arrays organisiert, wie z.B. mitotische Spindeln, Ziliaraxoneme, neuronale Bündel, Interphasenarrays und pflanzliche kortikale Arrays. Ein allgegenwärtiges architektonisches Motiv, das in diesen Strukturen zu finden ist, ist ein Bündel von Mikrotubuli, die entlang ihrer Länge miteinander verbunden sind1. Ein faszinierendes Merkmal mehrerer Mikrotubuli-basierter Strukturen ist die Koexistenz von gebündelten Mikrotubuli und nicht vernetzten Einzelmikrotubuli in unmittelbarer räumlicher Nähe. Diese Mikrotubuli-Subpopulationen können eine stark unterschiedliche Polymerisationsdynamik aufweisen, die für ihre ordnungsgemäße Funktion erforderlich ist2,3,4,5. Zum Beispiel sind innerhalb der mitotischen Spindel stabile vernetzte Bündel und dynamische einzelne Mikrotubuli innerhalb einer mikrometerskaligen Region im Zellzentrum vorhanden6. Die Untersuchung, wie die dynamischen Eigenschaften koexistierender Mikrotubulipopulationen spezifiziert werden, ist daher von zentraler Bedeutung für das Verständnis des Aufbaus und der Funktion von Mikrotubuli-basierten Strukturen.
Mikrotubuli sind dynamische Polymere, die zwischen Phasen der Polymerisation und Depolymerisation wechseln und zwischen den beiden Phasen in Ereignissen, die als Katastrophe und Rettung bekannt sind7 wechseln. Die Dynamik zellulärer Mikrotubuli wird durch unzählige Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAPs) reguliert, die die Raten der Mikrotubuli-Polymerisation und -Depolymerisation sowie die Häufigkeit von Katastrophen- und Rettungsereignissen modulieren. Es ist eine Herausforderung, die Aktivität von MAPs auf räumlich proximalen Arrays in Zellen zu untersuchen, da die räumliche Auflösung in der Lichtmikroskopie begrenzt ist, insbesondere in Regionen mit hoher Mikrotubulidichte. Darüber hinaus behindert das Vorhandensein mehrerer MAPs in derselben Zellregion die Interpretation zellbiologischer Studien. In-vitro-Rekonstitutionstests, die in Verbindung mit der TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) durchgeführt werden, umgehen die Herausforderungen der Untersuchung von Mechanismen, mit denen bestimmte Untergruppen von MAPs die Dynamik proximaler zellulärer Mikrotubuli-Arrays regulieren. Hier wird die Dynamik von in vitro zusammengesetzten Mikrotubuli in Gegenwart eines oder mehrerer rekombinanter MAPs unter kontrollierten Bedingungen untersucht8,9,10. Konventionelle Rekonstitutionsassays werden jedoch typischerweise an einzelnen Mikrotubuli oder an einer Art von Array durchgeführt, was die Visualisierung koexistierender Populationen ausschließt.
Hier stellen wir in vitro Rekonstitutionsassays vor, die die gleichzeitige Visualisierung von zwei Mikrotubulipopulationen unter den gleichen Lösungsbedingungen ermöglichen11. Wir beschreiben eine Methode, um gleichzeitig die kollektive Aktivität mehrerer MAPs auf einzelnen Mikrotubuli und auf Mikrotubulibündeln zu betrachten, die mit dem mitotischen Spindel-assoziierten Protein PRC1 vernetzt sind. Das Protein PRC1 bindet bevorzugt an der Überlappung zwischen antiparallelen Mikrotubuli und vernetzt sie9. Kurz gesagt, dieses Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: (i) Herstellung von Stammlösungen und Reagenzien, (ii) Reinigung und Oberflächenbehandlung von Deckgläsern, die zur Herstellung der Bildgebungskammer für Mikroskopieexperimente verwendet werden, (iii) Herstellung stabiler Mikrotubuli-“Samen”, von denen während des Experiments eine Polymerisation eingeleitet wird, (iv) Spezifikation von TIRF-Mikroskopeinstellungen zur Visualisierung der Mikrotubuli-Dynamik, (v) Immobilisierung von Mikrotubuli-Samen und Erzeugung von vernetzten Mikrotubuli-Bündeln in der Bildgebungskammer und (vi) Visualisierung der Mikrotubulidynamik in der Bildgebungskammer durch TIRF-Mikroskopie unter Zugabe von löslichem Tubulin, MAPs und Nukleotiden. Diese Assays ermöglichen die qualitative Bewertung und quantitative Untersuchung der MAP-Lokalisierung und ihrer Wirkung auf die Dynamik zweier Mikrotubuli-Populationen. Darüber hinaus erleichtern sie die Bewertung der synergistischen Effekte mehrerer MAPs auf diese Mikrotubulipopulationen unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Experiment erweitert den Umfang und die Komplexität herkömmlicher Mikrotubuli-Rekonstitutionsassays, die traditionell an einzelnen Mikrotubuli oder an einem Array-Typ durchgeführt werden, erheblich. Der aktuelle Assay bietet eine Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung und zum Vergleich der regulatorischen MAP-Aktivität an zwei Populationen, nämlich einzelnen Mikrotubuli und vernetzten Bündeln. Darüber hinaus ermöglicht dieser Assay die Untersuchung von zwei Arten von Bündeln: solchen, d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des NIH (Nr. 1DP2GM126894-01) und durch Mittel der Pew Charitable Trusts und der Smith Family Foundation an R.S. unterstützt. Die Autoren danken Dr. Shuo Jiang für seinen Beitrag zur Entwicklung und Optimierung der Protokolle.
Materials
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18×18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24×60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 | |
Referências
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