Summary
Il presente protocollo descrive le linee guida passo-passo per le tecniche operative RNAi in P. americana.
Abstract
Gli scarafaggi, un parassita sanitario, sono specie essenziali negli studi sullo sviluppo degli insetti e metamorfici grazie alla loro facile alimentazione e alle caratteristiche emimetaboliche. Complessivamente con sequenze di genoma ben annotate, questi vantaggi hanno reso lo scarafaggio americano, Periplaneta americana, un importante modello di insetto emimetabolico. Limitato dalla carenza di strategia di knockout, l'efficace knockdown genico basato sull'interferenza dell'RNA (RNAi) diventa una tecnica indispensabile nella ricerca genica funzionale di P. americana. Il presente protocollo descrive le tecniche di funzionamento RNAi in P. americana. Il protocollo include (1) la selezione della P. americana nelle fasi di sviluppo appropriate, (2) la preparazione per l'impostazione dell'iniezione, (3) l'iniezione di dsRNA e (4) il rilevamento dell'efficienza del knockdown genico. RNAi è un potente strumento genetico inverso in P. americana. La maggior parte dei tessuti di P. americana sono sensibili al dsRNA extracellulare. La sua semplicità consente ai ricercatori di ottenere rapidamente fenotipi disfunzionali sotto una o più iniezioni di dsRNA, consentendo ai ricercatori di utilizzare meglio il P. americana per studi di sviluppo e metamorfici.
Introduction
L'interferenza dell'RNA (RNAi), un meccanismo conservato evolutivamente, diventa gradualmente uno strumento genetico inverso essenziale per inibire l'espressione genica in molti organismi1, da quando Andrew Fire e Craig Mello2 hanno sviluppato la strategia di silenzio genico mediato dall'RNA a doppio filamento (dsRNA). Il dsRNA viene scisso in frammenti di 21-23 nucleotidi, piccoli RNA interferenti (siRNA), dall'enzima Dicer nelle cellule per attivare la via dell'RNAi. Quindi i siRNA vengono incorporati nel complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC), che si accoppia all'mRNA bersaglio, provoca la scissione dell'mRNA e infine provoca la perdita della funzione genica 3,4,5. Tra le specie di insetti, molti esperimenti sistemici RNAi sono stati finora segnalati in molti ordini di insetti, come Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Ditteri, Hymenoptera, Lepidoptera e Blattodea 5,6,7,8.
Gli scarafaggi (Blattaria) sono una famiglia di insetti essenziale negli studi sullo sviluppo e metamorfici con i loro rapidi cicli di crescita, la forte adattabilità all'ambiente e l'elevata plasticità dello sviluppo9. Prima di scoprire che l'RNAi era compatibile con gli scarafaggi, la ricerca precedente si è concentrata solo sulla prevenzione e il controllo degli scarafaggi a causa della scarsità di tecniche di manipolazione genetica negli scarafaggi. La struttura unica dell'ooteca scarafaggio ha reso difficile eseguire il knockout genetico basato sull'iniezione di embrioni con il sistema CRISPR-Cas9. Inoltre, la maggior parte dei tessuti negli scarafaggi (come P. americana) mostra una robusta risposta sistemica all'RNAi, consentendo la rapida generazione di fenotipi disfunzionali iniettando uno o più dsRNAmirati 9,10,11. Queste caratteristiche hanno reso l'RNAi una tecnica indispensabile nella ricerca funzionale genica in P. americana.
Anche se è stato riportato l'uso di RNAi nella ricerca sui geni funzionali in P. americana , non era disponibile alcuna descrizione dettagliata o dettagliata. Questo rapporto fornisce una linea guida operativa passo-passo per RNAi in P. americana, utile per lo studio della funzione genica in altri scarafaggi. Inoltre, questa guida non si limita a Blattodea e può essere applicata a molti altri insetti con piccole modifiche.
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Protocol
La linea di P. americana è stata inizialmente fornita dal Dr. Huiling Hao. Questa specie è stata mantenuta consanguineità per 30 anni9.
1. Schiusa e alimentazione di P. americana
- Raccogliere oothecae fresche (immediatamente dopo la deposizione delle uova) di P. americana e incubare nell'incubatrice scura a 25 ° C e 60% di umidità per ~ 25 giorni. Quindi aumentare la temperatura e l'umidità a 30 ° C e 75% 3 giorni prima della schiusa.
- Utilizzare un setaccio con apertura di 4 mm per separare le ninfe tratteggiate dalle oothecae.
- Tenere le ninfe in contenitori cilindrici (12 cm di diametro e 10 cm di altezza) al buio a 28 °C, 70% di umidità. Spazzolare il bordo interno dei contenitori con vaselina per evitare che gli scarafaggi fuoriescano. Fornire cibo per topi, acqua e riparo (vassoi per uova). Presta attenzione all'attività delle ninfe e pulisci regolarmente le feci e i detriti.
2. Selezione delle ninfe in instar corretta
- Usa un tubo di vetro per scegliere il P. americana appena fuso (bianco nel colore del corpo). Conservali in nuovi contenitori e attendi la fase corretta per il trattamento.
NOTA: Dopo ~ 19 giorni nelle condizioni di alimentazione di cui sopra, le ninfe nel 3° instars saranno disponibili per l'iniezione. Il colore degli scarafaggi appena fusi è bianco e le stelle sono chiarite dai tempi di muta.
3. Preparazione del frammento target con promotori T7
- Utilizzando il cDNA di P. americana come modello, progettare primer accoppiati per eseguire la PCR per ottenere un frammento di DNA da 300-800 bp del gene bersaglio9. Quindi clonare il frammento PCR in un vettore pTOPO (vedere Tabella dei materiali) per il sequenziamento.
- Utilizzando il DNA del frammento bersaglio come modello, sintetizzare una nuova coppia di primer con sequenza di promotori T7 (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') ai terminali 5' ed eseguire un altro ciclo di PCR per ottenere il frammento bersaglio con promotori T7 su ciascun lato9.
4. Trascrizione e sintesi di dsRNA in vitro
- Aggiungere 10 μL di tampone T7 2X, 2 μL della miscela enzimatica, T7 Express (vedere tabella dei materiali) e 2 μg di prodotto PCR (ottenuto al punto 3.2) nel sistema di reazione e aggiungere il volume totale a 20 μL con ddH2O. Mescolare delicatamente manualmente e incubare a 37 °C per 30 minuti e 70 °C per 10 minuti, e poi raffreddare lentamente a temperatura ambiente.
- Soluzione diluita di RNasi A (4 μg/μL) con ddH2O in rapporto 1:200. Quindi aggiungere al sistema 1 μL di DNasi RQ1 RNasi-Free (1 U/μL) e 1 μL di soluzione di RNasi A diluita (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Ora, il volume di un singolo sistema è di 22 μL. - Incubare a 37 °C per 30 min. Quindi aggiungere il 10% del volume totale (quando si eseguono reazioni N contemporaneamente, il volume totale è N x 22 μL) di acetato di sodio e tre volumi del volume totale di isopropanolo.
- Mescolare delicatamente a testa in giù manualmente, mettere su ghiaccio per 5 minuti e centrifugare a 13.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante con una pipetta, lavare il residuo con etanolo al 75% (con acqua trattata con pirocarbonato di dietile (DEPC) al 25%) e quindi centrifugare a 13.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Rimuovere di nuovo il surnatante. Asciugare all'aria il pellet per 15 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare ~ 100 μL di acqua DEPC per sciogliere il dsRNA, quindi diluire il dsRNA fino ai 2 μg / μL finali.
NOTA: Il dsRNA potrebbe essere conservato a -80 °C per 6 mesi.
5. Caricamento della soluzione di dsRNA nella siringa
- Impostare il programma nella pompa di microiniezione (vedere Tabella dei materiali) in anticipo per garantire che il volume di ciascuna iniezione sia coerente. Prima di utilizzare la siringa, pulire la siringa riempiendola con acqua DEPC 8-10 volte.
- Installare la siringa da 10 μL sulla pompa di microiniezione, avviare la pompa e riempire la siringa con 10 μL di soluzione di dsRNA (preparata al punto 4.6). Iniettare 1 μL del dsRNA in una ninfa3a instar (vedere il passo 2) e assicurarsi che non fuoriesca nel corpo.
6. Iniezione di dsRNA a P. americana
- Anestetizzare gli scarafaggi con una maggiore concentrazione di CO2 in un contenitore fino a quando gli scarafaggi non si muovono più, quindi procedere immediatamente con l'iniezione.
- Raccogli delicatamente lo scarafaggio con una pinzetta e consegna lo scarafaggio verso l'ago con la mano. Quindi, inserire l'ago attraverso lo spazio tra due somiti addominali orizzontalmente contro l'epidermide. A proposito di inserire la profondità, più basso, meglio è.
- Quindi, iniettare la soluzione di dsRNA nello scarafaggio. Infine, estrarre la punta dell'ago. Assicurarsi che la punta dell'ago sia il più vicino possibile all'epidermide per evitare di danneggiare gli organi interni.
NOTA: L'iniezione deve essere effettuata al microscopio di dissezione. - Metti gli scarafaggi iniettati in contenitori puliti per il biodosaggio. Attendere circa 10-20 minuti per farli recuperare dagli effetti della CO2 . Etichettare i contenitori con la data di iniezione, il tipo e la dose di dsRNA e l'età del P. americana.
- Posizionare gli scarafaggi iniettati in un ambiente buio a 28 ° C, 70% di umidità, fornire acqua, mangime e riparo e osservare regolarmente possibili cambiamenti nel fenotipo degli scarafaggi.
7. Conferma knockdown e analisi fenotipica
- Valutare l'efficienza dell'RNAi utilizzando tutte le tecniche di biologia molecolare disponibili come la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e il Western blotting. Per le procedure dettagliate di qRT-PCR e Western blotting, vedere i riferimenti 1,12.
- Per osservare e analizzare fenotipi correlati all'RNAi, utilizzare il microscopio adatto per animali viventi.
NOTA: RNAi può influenzare la morfologia, il comportamento, la muta, la rigenerazione degli arti e altre attività fisiologiche degli scarafaggi. La frequenza specifica del fenotipo viene calcolata in base a condizioni specifiche.
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Representative Results
La Figura 1 mostra un'iniezione riuscita. La siringa per microiniezione con un ago di microdiametro deve essere posizionata orizzontalmente sul booster (Figura 1A). L'ago viene inserito attraverso lo spazio tra due somiti addominali orizzontalmente contro l'epidermide (Figura 1B). Assicurarsi che il liquido entri nell'addome di P. americana . L'angolo troppo ripido dell'ago danneggerà gli organi interni (Figura 1C) e un'iniezione impropria porta alla fuoriuscita della soluzione di dsRNA dall'addome (Figura 1D). Se fuoriesce dsRNA, l'animale deve essere scartato e viene eseguita un'altra iniezione. Il P. americana deve essere completamente anestetizzato durante l'iniezione.
Come altri esperimenti biologici, i gruppi di controllo sono necessari quando viene eseguito il trattamento con RNAi. Le differenze di trattamento devono essere confermate causate da RNAi mirato invece che a causa degli effetti fuori bersaglio del dsRNA, del danno durante l'iniezione o dell'anestesia con CO2. Qui i geni Ddc (Dopa decarbossilasi) e Dpp (decapentaplegici) sono stati selezionati come due esempi per osservare il fenotipo degli scarafaggi fusi dopo l'iniezione di dsRNA, e un controllo negativo dsMock11 che non ha bersaglio negli animali, è stato eseguito come controllo negativo, l'efficienza RNAi è stata rilevata da qRT-PCR (Figura 2). Prendendo l'iniezione di dsDdc come esempio (Figura 3A,B), la P. americana con il gene Ddc abbattuto avrebbe l'epidermide bianca per molto tempo poiché la melanizzazione è bloccata (Figura 3B). Nell'esperimento delle iniezioni di dsDpp, che sono necessarie per la rigenerazione degli arti, l'RNAi ha interrotto la rigenerazione dell'arto (Figura 4), che è stata riportata in precedenza9.
Figura 1: Strumento e corretto funzionamento dell'iniezione. (A) La siringa sullo strumento di microiniezione. (B) Posizione corretta dell'ago per iniezione; non esce liquido. (C) L'angolo troppo ripido dell'ago per iniezione può danneggiare gli organi interni. (D) L'iniezione fallita provoca la soluzione di dsRNA o l'emolinfa che fuoriesce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Efficienza RNAi rilevata da qRT-PCR. L'efficienza di abbattimento dei geni Ddc e Dpp è stata rilevata dalla qRT-PCR e il dsMock è stato utilizzato come controllo negativo. Sono state utilizzate tre repliche per ogni trattamento e le barre di errore indicano la deviazione standard delle tre repliche. Il significato delle differenze è stato analizzato dal t-test di Student. *: P < 0,05, **: P < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempi di RNAi di successo per l'interruzione della melanizzazione dell'epidermide in P. americana. (A) Scarafaggio normale dopo iniezione didsMock con melanizzazione normale. (B) Ddc RNAi ha mediato la P. americana albinica dopo la muta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esempi di RNAi di successo per l'interruzione della rigenerazione degli arti in P. americana. (A) A P. americana con una zampa posteriore amputata. (B-C) P. americana dopo trattamenti RNAi e muta. La zampa posteriore è stata rigenerata nel gruppo di controllo dsMock (B) ma non quando il gene Dpp (C) è stato messo a tacere. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo rapporto descriveva una strategia metodologica passo-passo RNAi in P. americana; da notare, può anche essere applicato ad altri scarafaggi (Blattella germanica, per esempio) e molti altri insetti con piccoli cambiamenti. Tuttavia, l'efficienza di silenziamento genico dell'RNAi non è sempre abbastanza elevata, con un evidente svantaggio rispetto alla strategia di knockout genico13. Il seguente effetto residuo del livello genico può interferire con i fenotipi reali. Per garantire il successo del trattamento con RNAi, è necessario considerare diverse condizioni essenziali, tra cui la condizione fisica degli animali, la selezione del gruppo di controllo, la lunghezza e la concentrazione delle molecole di dsRNA, l'evitare la possibilità di effetti off-target (OTE) e la diversa sensibilità dei tessuti al dsRNA.
Condizione fisica di P. americana
Gli animali sani sono la premessa per il successo dell'RNAi e di diversi studi funzionali genici in P. americana. Inoltre, per mantenere coerenti gli esperimenti, vengono scelti solo gli scarafaggi che sono stati allevati nelle stesse condizioni. E solo le ninfe che sono più vecchie del 3° instar (circa 19 giorni dopo la schiusa) possono essere utilizzate perché le ninfe più giovani sono troppo piccole per l'iniezione nelle dimensioni del corpo.
Selezione del gruppo di controllo
dsMock11 e dsEGFP e la stessa dose di scarafaggio soluzione salina6 sono stati usati come controlli negativi. Le sequenze bersaglio dei controlli negativi devono essere esogene e non avere omologia con la sequenza genetica endogena11. dsMock è stato preferito perché l'uso di dsEGFP avrebbe ritardato la crescita e lo sviluppo di P. americana in una certa misura.
Lunghezza del dsRNA
L'efficienza dell'RNAi è influenzata dalla lunghezza delle molecole di dsRNA. I frammenti di dsRNA più lunghi sono più efficaci nel silenziamento dell'mRNA, probabilmente perché produce più siRNA, o frammenti di dsRNA più brevi vengono assorbiti dalle cellule in modo meno efficiente 1. In P. americana e B. germanica, il dsRNA tra 300 bp e 800 bp appare ideale per gli esperimenti RNAi 6,9,10,14. Un dsRNA corto può essere insufficiente per indurre una risposta sistemica all'RNAi, mentre un dsRNA lungo può aumentare il rischio di OTE1.
Concentrazione di dsRNA
La concentrazione di dsRNA può anche influenzare l'efficienza di RNAi 1,15. Perle 3 ninfe instar di P. americana, 1 μg di dsRNA sembra essere una quantità ragionevole e 4-6 μg è adatto per adulti 6,9,14,16. La quantità precisa di dsRNA utilizzata per l'iniezione può essere regolata in base ai geni, ai tessuti e alle dimensioni corporee della P. americana.
Effetti fuori bersaglio
L'OTE di RNAi è difficile da evitare del tutto17,18. Due regioni non sovrapposte del dsRNA possono essere progettate per ridurre l'effetto dell'OTE sui fenotipi5. Se i dsRNA che prendono di mira due regioni distinte producono lo stesso effetto, potrebbe essere esclusa la possibilità di un fenomeno di falsi positivi indotto da OTE.
Metodo per il rilevamento dell'efficienza RNAi
L'analisi fenotipica è l'approccio più intuitivo per valutare l'RNAi, e l'analisi qRT-PCR e Western blotting sono i due standard d'oro per misurare l'efficienza di abbattimento. qRT-PCR è un metodo semplice per determinare l'efficienza delle interferenze a livello di mRNA 6,9,10. I primer dovrebbero essere progettati al di fuori della regione di targeting del dsRNA. L'analisi Western blotting è un altro metodo per analizzare l'interferenza a livello proteico, ma richiede anticorpi specifici. Tuttavia, a volte non si osservano particolari effetti fenotipici, anche con un'elevata efficienza di silenziamento (>90%). Una possibile spiegazione di questo effetto residuo è la massiccia espansione della famiglia genica negli scarafaggi; le ridondanze dei geni controllano molte funzioni e fenotipi particolari. Un'altra possibile spiegazione è che il livello minimo di espressione genica richiesto per una sufficiente funzionalità è estremamente basso. Questi portano al fallimento nell'ottenere un particolare fenotipo anche con un'efficienza RNAi abbastanza elevata.
Specificità tissutale per la sensibilità RNAi
L'efficienza di interferenza in alcuni tessuti di scarafaggi (come l'ovaio e le ghiandole accessorie) non è abbastanza elevata, che potrebbe essere la barriera penetrante per il dsRNA 5,19; si osserva anche la diversa efficacia dell'RNAi in diverse specie di insetti, che dipende dalla degradazione enzimatica del dsRNA nell'emolinfa15,20. Alcune idee sono ragionevoli per migliorare l'efficienza dell'RNAi nei tessuti di P. americana, come digerire il dsRNA in siRNA in siRNA in vitro21, aumentare la dose di dsRNA e i tempi di iniezione e utilizzare i nanomateriali come vettore per la consegna.
In conclusione, l'elevata efficienza dell'RNAi insieme alle sequenze genomiche ben annotate9 rende P. americana un buon modello per studiare la funzione genica in una vasta gamma di studi sullo sviluppo, fisiologici e comportamentali. Allo stesso modo, questo rapporto può servire come riferimento prezioso per altri insetti sensibili al dsRNA e mutazioni knockout difficili da realizzare.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 e 31572325 a C.R., Sh.L.), dalla Natural Science Foundation della provincia del Guangdong (Grant No. 2021B1515020044 e 2020A1515011267 a C.R.), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia nella Provincia del Guangdong (Grant Nos. 2019B090905003 e 2019A0102006), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia di Guangzhou (Grant No. 202102020110), dal Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 a Sh.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
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