合并的shRNA文库筛选，以确定调节耐药性表型的因素
Summary
使用慢病毒 shRNA 池的高通量 RNA 干扰 （RNAi） 筛选可以成为检测恶性肿瘤中治疗相关合成致死靶标的工具。我们提供一种合并的shRNA筛选方法来研究急性髓系白血病（AML）中的表观遗传效应子。
Abstract
了解获得性化疗耐药的临床相关驱动因素机制对于阐明规避急性髓系白血病 （AML） 患者耐药性和提高生存率的方法至关重要。一小部分在化疗后存活的白血病细胞具有稳定的表观遗传状态，可以耐受化疗损伤。进一步暴露于化疗使这些药物持久性细胞达到固定的表观遗传状态，这导致基因表达改变，导致这些耐药人群的增殖，并最终复发或难治性疾病。因此，确定需要耐药性白血病细胞存活的表观遗传调节至关重要。我们详细介绍了一种方案，用于鉴定表观遗传调节剂，该方案使用在获得性抗阿糖胞苷的AML细胞系中进行池化shRNA文库筛选来介导对核苷类似物阿糖胞苷（AraC）的抗性。该文库由5，485个shRNA构建体组成，靶向407个人类表观遗传因子，允许高通量表观遗传因子筛选。
Introduction
急性髓系白血病（AML）的治疗选择在过去近五十年中一直保持不变，阿糖胞苷（AraC）和蒽环类药物是治疗该疾病的基石。AML治疗成功的挑战之一是白血病干细胞对化疗的抵抗力，导致疾病复发1，2。表观遗传调控在癌症发病机制和耐药性中起着至关重要的作用，几种表观遗传因素已成为有希望的治疗靶点3，4，5。表观遗传调控机制影响持续暴露于化疗药物下的增殖和存活。非血液恶性肿瘤的研究表明，克服药物效应的一小部分细胞经历各种表观遗传学修饰，导致这些细胞的存活率6，7。然而，表观遗传因素在介导AML中对阿糖胞苷的获得性耐药性中的作用尚未得到探索。
高通量筛选是一种药物发现方法，随着时间的推移，它已经获得了全球的重要性，并已成为不同方面的标准方法，用于鉴定细胞机制中的潜在靶标，用于途径分析以及分子水平8，9。合成致死性概念涉及两个基因之间的相互作用，其中任何一个基因的扰动单独是可行的，但两个基因同时导致生存能力的丧失10。在癌症治疗中利用合成致死性可以帮助识别和机械地表征强大的合成致死遗传相互作用11。我们采用了具有合成致死性的高通量shRNA筛选的组合方法，以确定AML中导致获得性阿糖胞苷耐药性的表观遗传因素。
已知由混系白血病基因（MLL 或 KMT2A）染色体易位引起的急性白血病与患者生存率低有关。由此产生的 MLL 基因重排的嵌合产物，即MLL融合蛋白（MLL-FPs），可以在多种表观遗传因素的参与下将造血干细胞/祖细胞（HSPC）转化为白血病原始细胞。这些表观遗传调节剂构成了一个复杂的网络，决定了白血病计划的维持，因此可能形成潜在的治疗靶点。在这种情况下，我们使用MV4-11细胞系（含有MLL融合基因MLL-AF4和FLT3-ITD突变;称为MV4-11 P）来开发获得性阿糖胞苷抗性细胞系，称为MV4-11 AraC R。细胞系暴露于增加剂量的阿糖胞苷，从药物治疗中间歇性恢复，称为药物假期。通过 体外 细胞毒性测定评估半最大抑制浓度（IC50）。
我们使用由具有pZIP慢病毒主链的hEF1a启动子驱动的合并表观遗传shRNA文库（参见 材料表）。该文库包含靶向407个表观遗传因子的shRNA。每个因子有5-24个shRNA，总共有5，485个shRNA，包括5个非靶向对照shRNA。修饰的“UltrmiR”miR-30支架已针对高效的初级shRNA生物发生和表达12，13进行了优化。
该实验的轮廓如图 1A所示。目前的方案侧重于使用MV4-11 AraC R细胞系（图1B）中的表观遗传因子shRNA文库进行RNAi筛选，这是一种悬浮细胞系。该方案可用于筛选自己选择的任何耐药细胞系中的任何靶向文库。应该注意的是，贴壁细胞的转导方案将有所不同。
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA干扰（RNAi）广泛用于功能基因组学研究，包括siRNA和shRNA筛选。shRNA的好处是它们可以掺入质粒载体中并整合到基因组DNA中，从而实现稳定的表达，从而延长靶mRNA的敲低时间。与传统的阵列筛选（siRNA）相比，合并的shRNA文库筛选具有稳健性和成本效益。在全基因组筛选中鉴定特定类别蛋白质的本质可能很麻烦。靶向筛选方法可以揭示单个蛋白质对特定类别中癌细胞存活或耐药性的重要性，同时?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究部分由生物技术部BT / PR8742 / AGR / 36 / 773 / 2013向SRV拨款资助;和印度生物技术部BT /COE/34/SP13432/2015和印度科学技术部：EMR/2017/003880至P.B. RVS和P.B分别得到惠康DBT印度联盟IA/S/17/1/503118和IA/S/15/1/501842的支持。S.D.由CSIR-UGC奖学金支持，S.I.由ICMR高级研究奖学金支持。我们感谢Abhirup Bagchi，Sandya Rani和CSCR流式细胞术核心设施工作人员的帮助。我们还感谢MedGenome Inc.在高通量测序和数据分析方面的帮助。
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
Referências
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