Aislamiento de levaduras y mohos cultivables de los suelos para investigar la estructura de la población de hongos
Summary
Este protocolo es un método eficaz y rápido de cultivo de levaduras y el moho Aspergillus fumigatus a partir de grandes conjuntos de muestras de suelo en tan solo 7 días. Los métodos se pueden modificar fácilmente para acomodar una variedad de medios de incubación y temperaturas según sea necesario para los experimentos.
Abstract
El suelo alberga una increíble cantidad de vida microbiana, y cada gramo contiene hasta miles de millones de células bacterianas, arqueas y fúngicas. Los hongos multicelulares como los mohos y los hongos unicelulares, ampliamente definidos como levaduras, cumplen funciones esenciales en los ecosistemas del suelo como descomponedores de material orgánico y como fuentes de alimento para otros habitantes del suelo. La diversidad de especies de hongos en el suelo depende de una multitud de factores climáticos como la lluvia y la temperatura, así como de las propiedades del suelo, incluida la materia orgánica, el pH y la humedad. La falta de un muestreo ambiental adecuado, especialmente en regiones de Asia, África, América del Sur y América Central, dificulta la caracterización de las comunidades de hongos del suelo y el descubrimiento de nuevas especies.
Caracterizamos comunidades de hongos del suelo en nueve países de seis continentes utilizando ~ 4,000 muestras de suelo y un protocolo desarrollado en el laboratorio para el aislamiento de levaduras y mohos. Este protocolo comienza con un enriquecimiento selectivo separado para levaduras y el moho médicamente relevante Aspergillus fumigatus, en medios líquidos mientras inhibe el crecimiento bacteriano. Las colonias resultantes se transfieren a medios sólidos y se procesan posteriormente para obtener cultivos puros, seguidos de la caracterización genética posterior. La identidad de las especies de levadura se establece a través de la secuenciación de su región espaciadora transcrita interna (ITS) del grupo de genes de ARN ribosómico nuclear, mientras que la estructura de la población global de A. fumigatus se explora a través del análisis de marcadores de microsatélites.
El protocolo se aplicó con éxito para aislar y caracterizar las poblaciones de levadura del suelo y A. fumigatus en Camerún, Canadá, China, Costa Rica, Islandia, Perú, Nueva Zelanda y Arabia Saudita. Estos hallazgos revelaron información muy necesaria sobre los patrones globales en la diversidad de levaduras del suelo, así como la estructura de la población mundial y los perfiles de resistencia antifúngica de A. fumigatus. Este artículo presenta el método de aislamiento tanto de levaduras como de A. fumigatus a partir de muestras internacionales de suelo.
Introduction
Los hongos en los ecosistemas del suelo desempeñan un papel esencial en la descomposición de la materia orgánica, el ciclo de nutrientes y la fertilización del suelo1. Tanto los enfoques independientes del cultivo (es decir, secuenciación de alto rendimiento) como los centrados en el cultivo son ampliamente utilizados en el estudio de los hongos del suelo 2,3. Si bien la gran cantidad de datos generados por la secuenciación de metacódigo de barras de alto rendimiento es útil para dilucidar patrones a gran escala en la estructura y diversidad de la comunidad, el enfoque dependiente de la cultura puede proporcionar información altamente complementaria sobre las estructuras taxonómicas y funcionales de las comunidades de hongos, así como perfiles más específicos de organismos individuales a través de la diversidad aguas abajo y los análisis funcionales debido a la disponibilidad de cultivos de hongos puros.
A pesar de que rara vez superan los miles de células por gramo de suelo, las levaduras, ampliamente definidas como hongos unicelulares, son descomponedores esenciales y fuentes de alimento para otros habitantes del suelo 4,5. De hecho, las levaduras pueden ser los hongos predominantes del suelo en biosferas frías como la Antártida continental 6,7. El suelo es también un reservorio primario de levaduras médicamente relevantes que causan infecciones oportunistas graves en humanos y otros mamíferos8. A pesar de las similitudes morfológicas, las especies de levadura son filogenéticamente diversas y se encuentran entre los hongos filamentosos en dos filos principales, Ascomycota y Basidiomycota, dentro del reino fúngico9. Las levaduras carecen de una firma de ADN definitoria en el gen de código de barras fúngico, la región espaciadora transcrita interna (ITS) del grupo de genes de ARN ribosómico nuclear10, lo que las hace indistinguibles de otros hongos en las investigaciones de metagenómica y, por lo tanto, requieren el uso de métodos dependientes del cultivo para aislar especies de levaduras.
El siguiente protocolo se implementó para caracterizar las comunidades de levadura del suelo de nueve países e identificar las tendencias y patrones globales en la diversidad de levaduras del suelo 9,11,12. Los enfoques de metagenómica son de uso limitado cuando se estudian grupos específicos de organismos como las levaduras 2,3. Debido a su diversidad filogenética, las levaduras no se pueden distinguir de otros hongos basándose solo en la secuencia de ADN. Por lo tanto, el estudio de las poblaciones de levadura requiere el uso continuo del aislamiento dependiente del cultivo. Sin embargo, el cultivo a menudo consume mucho más tiempo y requiere más personal para realizar los experimentos. Por lo tanto, el protocolo se ha optimizado y optimizado para un procesamiento más rápido con personal limitado. La principal ventaja del cultivo es que las especies de levadura identificadas son levaduras vivas y no muertas, y por lo tanto es más probable que sean verdaderos habitantes del suelo en lugar de células transitorias presentes en los suelos. Se ha estimado que aproximadamente el 40% del ADN fúngico en el suelo son contaminantes de otros ambientes, extracelulares, o provienen de células que ya no están intactas, lo que provoca enfoques de secuenciación de alto rendimiento para sobreestimar la riqueza de hongos hasta en un 55%13. El aislamiento dependiente del cultivo puede confirmar fácilmente la identidad de las especies de levadura con el beneficio adicional de asegurar el cultivo puro para ser utilizado en análisis posteriores. De hecho, se identificaron cultivos puros de 44 nuevas especies de levaduras putativas utilizando este protocolo de aislamiento del suelo que permitió el uso de una variedad de métodos para estudiar sus propiedades taxonómicas y funcionales en detalle14.
El siguiente protocolo también se puede utilizar para aislar mohos presentes en el suelo, como A. fumigatus. Aspergillus fumigatus es un moho termófilo y saprófito con una amplia distribución global en el suelo15. Se ha aislado de numerosos entornos clínicos y no clínicos. El muestreo no clínico comúnmente incluye aire, desechos orgánicos (compost, polvo de sierra, desechos de bulbos de tulipanes) y suelo (suelos agrícolas, de jardín y naturales)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus es un patógeno oportunista humano que causa una serie de infecciones denominadas colectivamente aspergilosis, que afectan a más de 8 millones de personas en todo el mundo16,20. Aproximadamente 300.000 personas en todo el mundo sufren de aspergilosis invasiva, que es la forma más grave de aspergilosis16. Dependiendo de factores como la población de pacientes, el sitio de infección y la eficacia de la terapia antifúngica, la tasa de mortalidad puede ser tan alta como el 90%. En las últimas décadas, la resistencia a las terapias antifúngicas ha aumentado, lo que requiere esfuerzos de vigilancia global en poblaciones clínicas y ambientales para rastrear estos genotipos de resistencia 21,22,23. Dada su capacidad para crecer a temperaturas superiores a 50 °C, esta temperatura puede aprovecharse para seleccionar aislados de A. fumigatus del suelo utilizando métodos dependientes del cultivo. Los aislados de Aspergillus fumigatus se genotipan comúnmente en nueve loci de repetición corta en tándem (STR) altamente polimórficos, que han demostrado tener un alto poder discriminatorio entre cepas24. Estos genotipos STR se pueden comparar con otras poblaciones previamente encuestadas para rastrear la propagación de los genotipos de A. fumigatus, incluidos los genes de resistencia a los medicamentos, en todo el mundo.
A continuación describimos un protocolo para el aislamiento rápido de levaduras y A. fumigatus de muestras de suelo de una manera dependiente del cultivo. Dependiendo de la cantidad de suelo obtenido por muestra, las muestras de suelo se pueden compartir entre los dos protocolos. En comparación con métodos similares que aíslan levadura y A. fumigatus del suelo, este protocolo utiliza 10 veces menos suelo por aislado obtenido. Los estudios que intentan aislar A. fumigatus del suelo requieren entre 1 y 2 g de suelo por aislado, mientras que este protocolo requiere solo 0.1-0.2 g de suelo 18,19,25. Este protocolo utiliza plásticos y contenedores más pequeños que facilitan su diseño de alto rendimiento. Por lo tanto, se puede procesar un mayor número de muestras utilizando menos espacio para equipos como incubadoras y tambores. Las muestras de suelo se pueden procesar completamente para obtener aislamientos en tan solo 7 días. Este protocolo ha sido optimizado para permitir el procesamiento de hasta 150-200 muestras por día por persona.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo desarrollado para aislar levaduras y A. fumigatus del suelo es un método rápido y eficiente para el procesamiento de suelos de alto rendimiento y el aislamiento de hongos. El protocolo solo requiere una pequeña cantidad de suelo (0.1-0.2 g) por muestra, lo que permite muestrear más sitios con un esfuerzo similar. El rápido tiempo de respuesta garantiza que los resultados se puedan obtener en un corto período de tiempo y permite tiempo para solucionar problemas y repetir experimentos si es nece…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (Subvención No. ALLRP 570780-2021) y McMaster University.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
Referências
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