Выделение культурных дрожжей и плесени из почв для исследования структуры грибковой популяции
Summary
Этот протокол является эффективным, быстрым методом культивирования дрожжей и плесени Aspergillus fumigatus из больших наборов образцов почвы всего за 7 дней. Методы могут быть легко модифицированы для размещения диапазона инкубационных сред и температур по мере необходимости для экспериментов.
Abstract
Почва является домом для невероятного количества микробной жизни, причем каждый грамм содержит до миллиардов бактериальных, архейных и грибковых клеток. Многоклеточные грибы, такие как плесень и одноклеточные грибы, широко определяемые как дрожжи, выполняют важную роль в почвенных экосистемах в качестве разлагателей органического материала и в качестве источников пищи для других почвенных жителей. Грибковое разнообразие в почве зависит от множества климатических факторов, таких как количество осадков и температура, а также свойства почвы, включая органическое вещество, рН и влагу. Отсутствие адекватного отбора проб окружающей среды, особенно в регионах Азии, Африки, Южной Америки и Центральной Америки, препятствует характеристике почвенных грибковых сообществ и открытию новых видов.
Мы охарактеризовали сообщества почвенных грибов в девяти странах на шести континентах, используя ~ 4000 образцов почвы и протокол, разработанный в лаборатории для выделения дрожжей и плесени. Этот протокол начинается с раздельного селективного обогащения дрожжей и значимой с медицинской точки зрения плесени Aspergillus fumigatus в жидких средах при ингибировании роста бактерий. Полученные колонии затем переносятся в твердые среды и далее обрабатываются для получения чистых культур с последующей генетической характеристикой. Идентичность видов дрожжей устанавливается путем секвенирования их внутренней транскрибированной спейсерной области (ITS) кластера генов ядерной рибосомальной РНК, в то время как глобальная популяционная структура A. fumigatus исследуется с помощью анализа микросателлитных маркеров.
Протокол был успешно применен для изоляции и характеристики популяций почвенных дрожжей и A. fumigatus в Камеруне, Канаде, Китае, Коста-Рике, Исландии, Перу, Новой Зеландии и Саудовской Аравии. Эти результаты выявили столь необходимую информацию о глобальных моделях разнообразия почвенных дрожжей, а также о глобальной структуре населения и профилях устойчивости к противогрибковым препаратам A. fumigatus. В данной работе представлен метод выделения как дрожжей, так и A. fumigatus из международных образцов почвы.
Introduction
Грибы в почвенных экосистемах играют важную роль в разложении органического вещества, круговороте питательных веществ и удобрениипочвы 1. При изучении почвенных грибов 2,3 широко используются как культурозависимые (т.е. высокопроизводительное секвенирование), так и культурозависимые подходы. В то время как большой объем данных, генерируемых высокопроизводительным секвенированием метабаркода, полезен для выяснения широкомасштабных закономерностей в структуре и разнообразии сообществ, зависящий от культуры подход может обеспечить весьма взаимодополняющую информацию о таксономических и функциональных структурах грибковых сообществ, а также более конкретные профили отдельных организмов посредством последующего разнообразия и функционального анализа из-за наличия чистых грибковых культур.
Несмотря на то, что дрожжи, широко определяемые как одноклеточные грибы, редко превышают тысячи клеток на грамм почвы, являются важными разлагателями и источниками пищи для других жителей почвы 4,5. Фактически, дрожжи могут быть преобладающими почвенными грибами в холодных биосферах, таких как континентальная Антарктида 6,7. Почва также является основным резервуаром медицински значимых дрожжей, которые вызывают серьезные оппортунистические инфекции у людей и других млекопитающих8. Несмотря на морфологическое сходство, виды дрожжей филогенетически разнообразны и встречаются среди нитевидных грибов в двух основных типах, Ascomycota и Basidiomycota, в грибковом царстве9. Дрожжи не имеют определяющей днк-сигнатуры в гене штрихкодирования грибов, области внутреннего транскрибированного спейсера (ITS) кластера генов ядерной рибосомальной РНК10, что делает их неотличимыми от других грибов в исследованиях метагеномики и, таким образом, требует использования культурозависимых методов для выделения видов дрожжей.
Приведенный ниже протокол был реализован для характеристики почвенных дрожжевых сообществ девяти стран и выявления глобальных тенденций и закономерностей в разнообразии почвенных дрожжей 9,11,12. Подходы метагеномики имеют ограниченное применение при изучении целевых групп организмов, таких как дрожжи 2,3. Из-за их филогенетического разнообразия дрожжи не могут быть отличимы от других грибов только по последовательности ДНК. Таким образом, изучение популяций дрожжей требует постоянного использования культурозависимой изоляции. Тем не менее, культивирование часто значительно более трудоемко и требует большего количества персонала для выполнения экспериментов. Поэтому протокол был оптимизирован и оптимизирован для более быстрой обработки с ограниченным персоналом. Основным преимуществом культивирования является то, что идентифицированные виды дрожжей являются живыми дрожжами, а не мертвыми, и, таким образом, с большей вероятностью будут истинными обитателями почвы, а не переходными клетками, присутствующими в почвах. Было подсчитано, что примерно 40% грибковой ДНК в почве являются либо загрязняющими веществами из других сред, внеклеточных, либо поступают из клеток, которые больше не являются неповрежденными, что приводит к высокопроизводительному секвенированию подходов к переоценке грибкового богатства на целых 55% 13. Культурозависимая изоляция может легко подтвердить идентичность видов дрожжей с дополнительным преимуществом обеспечения чистой культуры для использования в последующих анализах. Действительно, чистые культуры 44 предполагаемых новых видов дрожжей были идентифицированы с использованием этого протокола изоляции почвы, что позволило использовать ряд методов для детального изучения их таксономических и функциональных свойств14.
Приведенный ниже протокол также может быть использован для выделения плесени, присутствующей в почве, такой как A. fumigatus. Aspergillus fumigatus представляет собой термофильную и сапрофитную плесень с широким глобальным распространением в почве15. Он был выделен из многочисленных клинических и неклинических сред. Доклинический отбор проб обычно включает воздух, органический мусор (компост, опилки, отходы луковиц тюльпанов) и почву (сельскохозяйственные, садовые и естественные почвы)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus является оппортунистическим патогеном человека, вызывающим ряд инфекций, в совокупности называемых аспергиллезом, затрагивая более 8 миллионов человек во всем мире16,20. Приблизительно 300 000 человек во всем мире страдают от инвазивного аспергиллеза, который является наиболее тяжелой формой аспергиллеза16. В зависимости от таких факторов, как популяция пациентов, место инфекции и эффективность противогрибковой терапии, смертность может достигать 90%. За последние несколько десятилетий устойчивость к противогрибковой терапии возросла, что потребовало глобальных усилий по эпиднадзору как в клинических, так и в экологических популяциях для отслеживания этих генотипов резистентности 21,22,23. Учитывая его способность расти при температурах выше 50 ° C, эта температура может быть использована для отбора изолятов A. fumigatus из почвы с использованием методов, зависящих от культуры. Изоляты Aspergillus fumigatus обычно генотипируются в девяти высокополиморфных локусах короткого тандемного повтора (STR), которые, как показано, обладают высокой дискриминирующей силой между штаммами24. Эти генотипы STR можно сравнить с другими ранее обследованными популяциями для отслеживания распространения генотипов A. fumigatus, включая гены лекарственной устойчивости, по всему миру.
Ниже мы опишем протокол для быстрого выделения дрожжей и A. fumigatus из образцов почвы в зависимости от культуры. В зависимости от количества почвы, полученной на образец, образцы почвы могут быть разделены между двумя протоколами. По сравнению с аналогичными методами, которые изолируют дрожжи и A. fumigatus из почвы, этот протокол использует в 10 раз меньше почвы на полученный изолят. Исследования, направленные на изоляцию A. fumigatus от почвы, требуют от 1 до 2 г почвы на изолят, тогда как этот протокол требует только 0,1-0,2 г почвы 18,19,25. Этот протокол использует меньшие пластмассы и контейнеры, которые облегчают его высокопроизводительную конструкцию. Поэтому большее количество образцов может быть обработано с использованием меньшего пространства для оборудования, такого как инкубаторы и роликовые барабаны. Образцы почвы могут быть полностью обработаны для получения изолятов всего за 7 дней. Этот протокол был оптимизирован, чтобы позволить обрабатывать до 150-200 образцов в день на человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, разработанный для выделения дрожжей и A. fumigatus из почвы, является быстрым и эффективным методом высокопроизводительной обработки почвы и грибковой изоляции. Протокол требует только небольшого количества почвы (0,1-0,2 г) на образец, что позволяет отбирать больше участков с а…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (Грант No. ALLRP 570780-2021) и Университета Макмастера.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
Referências
- Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
- Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
- Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
- Yurkov, A. M. Yeasts of the soil – obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
- Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
- Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
- Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
- Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. . The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).
- Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
- Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
- Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
- Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
- Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
- Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
- Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
- Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
- Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
- Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
- Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
- Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
- de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
- Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
- Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
- Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genética. 111 (4), 715-734 (1985).
- Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
- Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
- De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
- Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
- Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
- Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
- Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
- Wang, H. -. C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).
