Summary
Her beskriver vi isolasjon, forsterkning og differensiering av primære humane neseepitelceller (HNE) ved luftvæskegrensesnittet og en biobankprotokoll som gjør det mulig å fryse og deretter tine forsterket HNE. Protokollen analyserer elektrofysiologiske egenskaper til differensierte HNE-celler og CFTR-relatert kloridsekresjonskorreksjon ved ulike modulatorbehandlinger.
Abstract
Humane neseepitelceller (HNE) er enkle å samle opp ved enkel, ikke-invasiv nesepussing. Pasientavledede primære HNE-celler kan forsterkes og differensieres til et pseudo-stratifisert epitel i luft-væske grensesnittforhold for å kvantifisere syklisk AMP-mediert klorid (Cl-) transport som en indeks av Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) funksjon. Hvis kritiske trinn som kvalitet på nesepussing og celletetthet ved kryopreservering utføres effektivt, kan HNE-celler lykkes med å biobankes. Videre viser kortslutningsstrømstudier at frysetining ikke endrer HNE-cellenes elektrofysiologiske egenskaper og respons på CFTR-modulatorer betydelig. I kulturforholdene som brukes i denne studien, når mindre enn 2 x 106 celler er frosset per kryolege, er feilfrekvensen svært høy. Vi anbefaler å fryse minst 3 x 106 celler per kryo toårig. Vi viser at doble terapier som kombinerer en CFTR-korrigerer med en CFTR-potensiering, har en sammenlignbar korreksjonseffekt for CFTR-aktivitet i F508del-homozygote HNE-celler. Trippelterapi VX-445 + VX-661 + VX-770 betydelig økt korreksjon av CFTR-aktivitet sammenlignet med dobbel terapi VX-809 + VX-770. Målet på CFTR-aktivitet i HNE-celler er en lovende preklinisk biomarkør som er nyttig for å veilede CFTR-modulatorbehandling.
Introduction
Cystisk fibrose (CF) er en autosomal resessiv lidelse som følge av mutasjoner i Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) genet som fører til fravær eller dysfunksjon av CFTR-proteinet, en anionkanal som ligger på den apikale overflaten av epithelia 1,2. Nylige fremskritt innen CFTR-behandling har forbedret prognosen for sykdommen, og de siste godkjente legemidlene som kombinerer CFTR-korrigerere og CFTR-potensiatorer førte til store forbedringer i lungefunksjon og livskvalitet for CF-pasienter som bærer den hyppigste mutasjonen p.Phe508del mutasjon (F508del)3,4. Til tross for denne lovende terapeutiske fremgangen, er rundt 10% av CF-pasientene ikke kvalifisert da de bærer mutasjoner som ikke kan reddes av disse CFTR-modulatorene. For disse pasientene er det behov for å teste andre legemidler eller legemiddelkombinasjoner for å finne den mest effektive kombinasjonen for spesifikke mutasjoner, og fremhever viktigheten av personlige terapier.
Humane neseepitelceller (HNE) er enkle å samle inn ved enkel, ikke-invasiv nesepussing og tillater kvantifisering av syklisk AMP-mediert klorid (Cl−) transport som en indeks for CFTR-funksjon. HNE-celler gir en nøyaktig modell av menneskelig luftvei, men levetiden er begrenset i kulturen. Takket være optimaliseringen av kulturteknikker kan pasientavledede primære HNE-celler omprogrammeres betinget med Rho-assosiert kinasehemmer (ROCKi), forsterket og differensiert til et pseudo-stratifisert epitel i luftvæskegrensesnitt (ALI) forhold på mikroporøs filtre 5,6. Tallrike kulturprotokoller for HNE-kultur eksisterer (kommersielt tilgjengelig, serumfri, "hjemmelaget", samkultur med materceller, etc.), og valg av medie- og kulturforhold har blitt beskrevet for å påvirke vekst, cellepopulasjonsdifferensiering og epitelfunksjon 7,8. Protokollen her presenterer en forenklet, materfri ROCKi-forsterkningsmetode som gjør det mulig å skaffe et stort antall HNE-celler som deretter differensieres hos ALI for CFTR-funksjonsanalyser.
Vi har vist at i differensierte HNE-celler er en 48 timers behandling med CFTR-modulatorer tilstrekkelig til å indusere elektrofysiologisk korreksjon av CFTR-avhengig Cl-strøm og at korreksjonen observert in vitro kan korreleres med pasientens kliniske forbedring9. HNE-celler representerer derfor en passende modell ikke bare for grunnleggende CF-forskning, men for prekliniske studier med pasientspesifikk CFTR-modulatortesting. I denne sammenhengen med personlig terapi var målet med protokollen å validere at kryopreserverte HNE-celler fra CF-pasienter, dyrket under våre forhold, var en passende modell for CFTR-korreksjonsstudier, og lignende resultater kunne forventes ved sammenligning av CFTR-avhengige Cl-transport fra friske og frosne celler. Studien vurderte også ulike CFTR-modulatorers effekt ved bruk av dobbelt- og trippelbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført etter retningslinjene og forskriftene beskrevet av Helsinkideklarasjonen og Huriet-Serusclat-loven om menneskelig forskningsetikk.
1. Forberedelse av kolber og forskjellige medier
- Forbered forsterkning, luftvæske og frysemedium som beskrevet i tabell 1.
- Forbered en lagerløsning av human kollagen IV ved å oppløse 50 mg kollagen i 100 ml 0,2% issyre. Bland på en magnetisk rører i minst 1 time, og filtrer steriliser løsningen. Oppbevars ved 4 °C i opptil 6 måneder i en glassflaske, beskyttet mot lys.
- Forbered en arbeidsløsning av kollagen IV ved å fortynne lagerløsningen 1:5 i dobbeltdestillert vann. Oppbevars ved 4 °C i opptil 6 måneder.
- Belegge plastcellekulturflasker eller transwellfiltre med kollagenarbeidsløsningen. Fordel jevnt 100 μL for 0,33 cm2 transwellfiltre, 500 μL for 25 cm2 kolber og 1 ml for 75 cm2 kolber på hele vekstflaten på kolben.
MERK: Dette kan oppnås ved å forsiktig øke kolben fra side til side. Alternativt, for å lette belegget av kolber, kan et økt volum brukes, og når hele overflaten er jevnt dekket, er kollagenoppløsningen aspirert for å forlate bare det angitte volumet. Den aspirerte kollagenoppløsningen kan deretter brukes umiddelbart til å belegge neste kolbe (dvs. for tre 75 cm2 kolber, fordel 3 ml kollagenoppløsning jevnt i den første kolben, aspirer 2 ml, som deretter brukes til neste kolbe og så videre). - La cellekulturflaskene ligge i inkubatoren i minst 2 timer eller over natten. Aspirer kollagenet grundig og la kolbeene tørke i inkubatoren eller under hetten i minst 20 minutter eller over natten.
- Vask med 10 ml Mg2+- og Ca2+-fri DPBS, la tørke i inkubatoren og oppbevar den i aluminiumsfolie for å beskytte mot lys. Oppbevar kolbeene i opptil 6 måneder ved romtemperatur (RT).
2. Nese børsting
MERK: Kontroller at nesebørsten utføres mens deltakeren ikke har en akutt infeksjon. Hvis CF-pasienter presenterer en lungeinfeksjon, se pasientens antibiogram og tilsett ekstra antibiotika til forsterkningsmediet. Humane neseepiteleceller ble samlet inn ved nesepussing fra F508del/F508del-pasienter som tidligere beskrevet9.
- Be pasienten blåse nesen, og bedøv deretter slimhinnen i begge neseborene ved hjelp av bomullsnett gjennomvåt i xylocaine 5% med naphazoline-løsning.
- Pensle forsiktig medialveggen og det dårligere turbinatet til begge neseborene ved hjelp av en cytologibørste. Bløtlegg børsten i et 15 ml rør med 2 ml kommersielt tilgjengelig spylemedium; rist forsiktig for å løsne celler. Gjenta børstingen i det andre neseboret.
- Tilsett følgende antibiotika i spylemediet: Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml), Tazocillin (10 μg/ml), Amfotericin B (2,5 μg/ml) og Colimycin (16 μg/ml).
MERK: Nesebørster kan sendes på RT til dedikerte laboratorier for utvidelse og kultur og kan frøs opptil 72 timer etter børsting.
3. Isolering av HNE
MERK: HNE ble isolert fra cytologibørsten, vasket med Mg2+- og Ca2+-fri DPBS, dissosiert med 0,25% Trypsin, og frø på en 25 cm2 plastflaske som tidligere beskrevet10.
- Løsne celler fra cytologibørsten ved gjentatte ganger å sende børsten gjennom en 1000 μL pipettekegle og skylling med 2 ml Mg2+- og Ca2+-fri DPBS. Sentrifuge ved 500 x g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten.
- Resuspend pellet i 0,25% Trypsin i 8-12 min for å dissosiere celler. Stopp den enzymatiske reaksjonen ved å tilsette 5 ml av forsterkningsmediet.
- Sentrifuge ved 500 x g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten. Resuspend pellet i 8 ml av forsterkningsmediet og frø på en 25 cm2 kollagenbelagt kolbe. Vokse ved 37 °C og 5 % CO2. Dette tilsvarer passasje 0.
- Neste dag erstatter du mediet med 5 ml ferskt forsterkningsmedium og overvåker cellene daglig for vedlegg, morfologi (celler skal ha et sammenhengende brosteinsutseende) og tall.
MERK: Den første såddtettheten varierer avhengig av kvaliteten på nesebørsten og andelen epitelceller. Nyisolerte HNE-celler når vanligvis 80% -90% samløp innen 3-10 dager. En lavere vekstrate tyder på utilstrekkelige epitelceller i prøven og bør kastes.
4. Forsterkning og passivisering av humane neseepitelceller
- Dyrk humane neseepitelceller i forsterkningsmediet ved 37 °C og 5 % CO2 på kollagenbelagte kolber til 80 %-90 % samløp, og endre medium hver 48-72 t. For 25 cm2 kolber, bruk 5 ml forsterkningsmedium og 10 ml for 75 cm2 kolber.
- Når cellene når 80% -90% samløp, vask cellene med 10 ml Mg2 + - og Ca2 + -fri DPBS, aspirer og kast.
- Tilsett 1 ml 0,25% Trypsin i en 25 cm2 kolbe (eller 2 ml Trypsin i en 75 cm2 kolbe) og gå tilbake til inkubatoren (37 °C, 5 % CO2) i 8–12 minutter.
- Trykk godt på kolben, med håndflaten, for å hjelpe cellene med å løsne.
- Tilsett 10 ml av forsterkningsmediet for å stoppe den enzymatiske reaksjonen. Skyll kolben kraftig ved hjelp av 10 ml pipetten for å trekke opp og utvise forsterkningsmediet over kolbeoverflaten for å skylle og løsne celler.
- Sentrifuge ved 500 x g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten.
- Resuspend pellet i 5-10 ml av forsterkningsmediet.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer.
MERK: Celler kan fryses på dette punktet (se trinn 5.1-5.3). Hvis ytterligere forsterkning er nødvendig, frø på kollagenbelagte kolber (en 25 cm2 kolbe kan utvides til tre 75 cm2 kolber, anbefales ikke en større fortynning).
5. Kryopreservering av primære neseepitelceller
MERK: Voks HNE-celler til passering 1 før biobanking for å oppnå nok celler til å lette celleveksten når de tines. Biobanking er imidlertid mulig ved første passering 0 eller passering 2. Følgende kryopreserveringstrinn er tilpasset alle passasjer.
- Etter celletelling, sentrifugering ved 500 x g i 5 min ved 4 °C, og kast den supernatante
- Resuspend pellet i det berikede frysemediet (tabell 1) for å oppnå 3 x 106-5 x 106 celler per ml og per kryo toårig.
- Frys cellene langsomt ved å redusere temperaturen ved ~ 1 °C per min i en passende kryofrysende beholder ved -80 °C. Neste dag flytter du den bevarte prøven til en nitrogenlagringsbeholder for langtidslagring (den nåværende studien er begrenset til 17 måneders lagring).
6. Tining av frosne forsterkede HNE-celler
- Varm opp vannbadet til 37 °C. Forbered forsterkningsmediet som beskrevet i tabell 1 og varm opp mediet til 37 °C.
- Fjern kryovarier fra nitrogenlagringstanken og plasser dem raskt i vannbadet, pass på at du ikke nedsenker hele hetteglasset i vannet. Fjern kryovialene fra vannbadet når bare en liten frossen dråpe forblir. Tørk av hetteglasset med 70 % alkohol, tørk av og legg det under panseret.
- Bruk en 1 ml pipette og overfør de opptinte cellene til et tomt 15 ml rør.
- På en dråpevis måte, tilsett 1 ml varmt forsterkningsmedium. Etter 1 min, legg til ytterligere 1 ml forsterkningsmedium og vent et ekstra minutt.
- Tilsett 10 ml av forsterkningsmediet og sentrifugen i 2 min ved 500 x g.
- Aspirer og kast supernatanten. Resuspend cellepellet i et volum av forsterkningsmedium som kreves for å oppnå en celletetthet på minst 1 x 106 celler / ml.
- Frø cellene på en kollagenbelagt kolbe som inneholder forsterkningsmediet.
- Hvis kryonalen inneholder mer enn 4 x 106 celler, frø på en 75 cm2 kolbe, i 10 ml av forsterkningsmediet
- Hvis kryo toårig inneholder mindre enn 4 x 106 celler, frøceller på en 25 cm2 kolbe, i 5 ml av forsterkningsmediet
- Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2, og observer celleutvidelse visuelt i løpet av de neste 2–3 dagene.
- Utfør deretter celleforsterkning som beskrevet i avsnitt 4.
MERK: Hvis få celler ble høstet i trinn 4.7. (dvs. ved frysing ved passering 0 før utvidelse), trinn 6.5. og 6.6. kan utelates, og celler kan frøs direkte på en 25 cm2 kollagenbelagt kolbe uten sentrifugering. Mediet må deretter endres neste dag for å fjerne dimetylsulfoksid (DMSO).
7. Differensiering av humane neseepitelceller ved luftvæskegrensesnittet
MERK: HNE ble differensiert ved luftvæskegrensesnittet som tidligere beskrevet10.
- Frø cellene med en tetthet på 330.000 celler / filter på 0,33 cm2 kollagenbelagte porøse filtre og supplement med 300 μL av forsterkningsmediet på den apikale siden og 900 μL av luftvæskemediet på basolateralsiden.
- Etter 3 dager aspirerer du det apikale mediet og kulturen cellene ved luftvæskegrensesnittet i 3-4 uker i luftvæskemediet for å etablere et differensiert epitel. Bytt basalmedium hver 48-72 timer.
8. CFTR-modulatorer
- Klargjør luftvæskemedium som inneholder CFTR-modulatorer. Bruk VX-445, VX-661 og VX-809 ved en endelig konsentrasjon på 3 μM og VX-770 ved 100 nM. Bruk korrigerende ABBV-2222 ved 1 μM sluttkonsentrasjon og potensiator ABBV-974 ved 10 μM. Bruk 100% DMSO for å oppløse alle CFTR-modulatorer.
- Forbered luftvæskemedium som inneholder samme mengde 100% DMSO som i korrigerende medium.
- Tilsett mediumholdige legemidler eller DMSO på basolateralsiden av polariserte HNE-celler som vokser ved et luftvæskegrensesnitt og inkuberer i 24 timer i 5 % CO2 ved 37 °C.
- Etter 24 timer aspirerer og kaster du mediet og erstatter det med ferskt medium tilberedt som i trinn 8.1-8.2., og ytterligere inkuberer i en 24 timers periode i 5% CO2 ved 37 °C.
9. Studier av Ussing-kammer
- Mål kortslutningsstrømmålinger (Isc) under spenningsklemmeforhold som tidligere beskrevet9.
MERK: Transepithelial elektrisk motstand (TEER) av kulturer ble målt med et spisepinne voltmeter, og bare kulturer som nådde minst 200 Ω·cm2 ble vurdert for følgende eksperimenter. Filtre av polariserte HNE-celler ble montert i Ussing-kamre, og kortslutningsstrømmålinger (Isc) ble målt under spenningsklemmeforhold.
10. Immunocytokjemi
- Utfør immundeteksjon som tidligere beskrevet9.
MERK: CFTR-immundeteksjon ble utført ved hjelp av anti-CFTR C-terminalen (24-1) monoklonalt antistoff over natten ved en 1/100 fortynning. Zona-occludens-1 (ZO-1) (1/500 fortynning), alfa-tubulin (1/300 fortynning), Muc 5AC (1/250 fortynning) og cytokeratin 8 (1/250 fortynning) farging ble gjort på ekstra filtre. Etter vask med PBS-Triton-X100 0,1%, ble geit sekundære antistoffer konjugert til Alexa 488 eller 594 lagt til i 30 min i 10% geitserum (1/1000 fortynning). Etter en siste vask ble filtre kuttet fra støtte og montert med Vectashield monteringsmedium som inneholder DAPI. Et konfokalt mikroskop (63x/1.4 olje differensial interferens kontrast λ blå PL APO mål) ble brukt til å fange bilder, som ble analysert med ImageJ programvare.
11. Statistisk analyse
- Utfør statistisk analyse ved hjelp av passende programvare.
MERK: Statistisk analyse ble utført ved hjelp av S.A.S-programvare. Etter hvert som flere HNE-filtre ble innhentet per pasient og per tilstand, ble kvantitative parametere uttrykt som medianverdier (± SEM) per pasient. Sammenligninger (gjennomsnittlig ± SD) ble utført ved hjelp av Wilcoxon-samsvarende par signert rangeringstest eller uparret t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Friske HNE-celler som dyrkes ved luftvæskegrensesnittet viser typiske trekk ved det polariserte og differensierte respiratoriske epitelet som vurderes ved immunstaining (figur 1). HNE-celler re-differensierer til et heterogent lag av epitelceller (positiv keratin 8 immunostaining) som etterligner in vivo-situasjonen til et pseudo-stratifisert respiratorisk epitel sammensatt av ciliated (positiv alfa-tubulinfarging) og ikke-ciliated slimproduserende begerceller (positiv Muc5Ac immunostaining). Det totale epitelet presenterer tette veikryss (vurdert av ZO-1, zona-occludens-1 farging). Sterk apikal CFTR-farging er synlig i ville HNE-celler (wild-type), og redusert CFTR-farging både på den apikale overflaten og i cytoplasma observeres i F508del/F508del HNE.
Vi vurderte positive resultater som prøver som ikke bare vellykket ekspanderende, men også vellykket differensiering til et pseudo-stratifisert epitel etter 3 uker ved luft-væske grensesnitt og presentere en TEER høyere enn 200 Ω·cm2, slik at kortslutning strømmålinger. Ettersom bare noen få dedikerte laboratorier utfører CFTR-relaterte Cl-sekresjonsanalyser ved kortslutningsstrømmålinger, krever prøver ofte transport fra sykehus til dedikerte anlegg.
I de 78 ferske HNE-celleprøvene ble suksessratene sammenlignet i nesebørster frøet umiddelbart og i børstefrø etter 1-7 dagers transport i spylemedium ved romtemperatur. De fleste prøvene (55 %) ble sådd 1 dag etter børsting, og 82 % av prøvene ble sådd innen 48 timer. Gjennomsnittlig prosentandel av vellykkede kulturer i alle de 78 prøvene var 82 % og nådde 87 % i prøver som ble sådd mellom dag 0 og dag 5 (tabell 2).
Suksess- og feilratene for identiske prøver differensiert i både friske og fryse-tinte forhold ble sammenlignet. 83% av prøvene som differensierte vellykket under friske forhold, lyktes også i kryopreserverte prøver. På samme måte, i prøver som ikke klarte å skille seg ut under friske forhold, var 71% også mislykket i fryse-tineforhold (tabell 2). Alle disse dataene antyder at kvaliteten på nesepussing er nøkkelfaktoren for en vellykket kultur.
Vi ønsket også å bestemme det optimale antall celler per kryovial. Prøver frosset ved passasje 0, fra en enkelt 25 cm2 tillater vanligvis bare å nå 1-1,5 x 106 celler per kolbe. Prøver frosset ved passasje 1 og forsterket til tre 75 cm2 kolber fikk vanligvis lov til å nå 10 x 106 celler, og dermed tillate å fryse flere hetteglass som inneholder minst 3 x 106 celler. I kulturforholdene som er beskrevet i denne protokollen, klarte ikke 50% av prøvene frosset mellom 2 x 106 og 3 x 106 celler per kryopisial å vokse når de ble tint, og nådde 80% når de var under 2 x 106 celler per kryopisial (tabell 2).
CFTR-relatert Cl-sekresjon gjenspeiler CFTR-funksjon og kan måles ved kortslutningsstrøm (Isc) eksperimenter i Ussing-kamre. Isc-varianten som svar på Forskolin (ΔIscForskolin) og CFTR-hemmer inh172 (ΔIscCFTRinh172) er de viktigste endepunktene for CFTR-korrigerende effektvurdering.
Kortslutningsstrømseksperimenter ble utført på enten fersk HNE, utvidet i forsterkningsmedium og frøet på filtre ved passering 2 og vokst ved luftvæskegrensesnitt i 3 uker i luftvæskemedium, eller fra HNE som tidligere hadde blitt frosset ved passasje 1 i beriket frysemedium, tint, utvidet og sådd på porøse filtre ved passasje 3. Kryopreserveringstidene varierte fra 3 måneder til 16 måneder, med et gjennomsnitt på 9,8 måneder. I kultur- og kryopreserveringsbetingelsene som er beskrevet i denne studien, ble det ikke observert noen signifikante endringer i vekst eller morfologi mellom ulike passasjer eller friske eller frosne F508del/F508del HNE-kulturer.
For både gjennomsnittlig ΔIscForskolin (figur 2A) og gjennomsnittlig ΔIscCFTRinh172 (figur 2B) i DMSO-behandlede HNE-celler ble det ikke observert noen signifikant forskjell mellom fersk eller frossent opptint HNE. For å vurdere om funksjonell korreksjon av CFTR ble påvirket av kryopreservering, ble gjennomsnittlige Isc-endringer målt i VX-809 + VX-770 behandlede celler sammenlignet med DMSO-behandlede HNE-celler hos friske (HNE-celler avledet fra n =78 pasienter) eller frossent opptinte HNE (HNE-celler avledet fra n = 9 pasienter) (figur 2). Både frosne og friske celler viste signifikant korreksjon ved behandling, med en betydelig økning i ΔIscForskolin (p < 0,05) (figur 2A) og en betydelig reduksjon i ΔIscCFTRinh172 (p < 0,05) (figur 2B). Gjennomsnittlig foldøkning for ΔIscForskolin (ΔIscForskolin VX-809 + VX-770/ΔIscForskolin DMSO) nådde 2,9 ± 1,6 i frosne HNE-celler og var ikke signifikant forskjellig fra foldøkningen i friske HNE-celler (2,5 ± 2,0). På samme måte reduseres folden i ΔIscCFTRinh172 (ΔIscCFTRinh172 VX-809 + VX-770/ΔIscCFTRinh172 DMSO) ble ikke signifikant påvirket av kryopreservering: 1,49 ± 0,9 i frossent opptint HNE sammenlignet med 2,5 ± 3,7 i fersk HNE.
Den funksjonelle korreksjonsaktiviteten til flere modulatorterapier ble videre undersøkt for å vurdere om denne HNE-cellemodellen kunne diskriminere mellom ulike behandlinger. Resultatene her kombinerer HNE-celler fra både friske og frosne opptinte forhold, da responsen på behandlingen ikke ble vesentlig endret ved kryopreservering (figur 2).
Vi vurderte først korrigerende respons fra to godkjente CFTR-modulatorbehandlinger på Cl-transport etter en 48 timers behandling med enten VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM ) eller VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM) i HNE-celler fra 10 F508del/F508del-pasienter (figur 3). Sammenlignet med DMSO-behandlede HNE-celler ble ΔIscForskolin (figur 3A) og ΔIscCFTRinh172 (figur 3B) betydelig forbedret av både VX-809 + VX-770 og VX-661 + VX-770. Begge behandlingene funksjonelt korrigert CFTR-relatert Cl- sekresjon til et lignende nivå, med en betydelig gjennomsnittlig foldøkning i ΔIscForskolin på 1,75 ± 1,39 for VX-809 + VX-770 (p < 0,001) og 0,97 ± 0,93 for VX-661 + VX-770 (s < 0,01). Gjennomsnittlig ΔIscCFTRinh172 foldreduksjon var 1,79 ± 2,04 for VX-809 + VX-770 (p < 0,001) og var ikke signifikant forskjellig gjennomsnittlig reduksjon av ΔIscCFTRinh172 ganger på 1,16 ± 1,44 for VX-661 + VX-770 (p < 0,001 vs. DMSO).
Tre forskjellige CFTR-modulatorbehandlinger i HNE fra seks F508del/F508del-pasienter (figur 4) ble ytterligere sammenlignet. Resultatene her kombinerer HNE-celler fra både friske og frosne tinte forhold. Både Vertex- og Abbvie CFTR-modulatorer, når de brukes som en kombinasjon av en CFTR-korrigerer og en CFTR-potensierer, korrigerte ΔIscForskolin (figur 4A) og ΔIscCFTRinh172 (figur 4B) i tilsvarende grad. Den delvise korreksjonen observert i figur 3 av VX-809 + VX-770 ble bekreftet i disse HNE-cellene med en gjennomsnittlig ΔIscForskolin fold økning på 2,87 ± 1,67 (p < 0,05). ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM) behandling induserte en lignende korreksjon som representerer 91% av VX-809 + VX-770 korreksjon for ΔIscForskolin (gjennomsnittlig ΔIscForskolin fold økning på 2,6 ± 1,4, p < 0,05 vs. DMSO) og 85 % av VX-809 + VX-770 for ΔIscCFTRinh172 (gjennomsnittlig reduksjon på ΔIscCFTRinh172 på 4,2 ± 5,7, p < 0,05 vs. DMSO).
Interessant, når HNE ble behandlet med trippelkombinasjonen VX-445 (3 μM) + VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM), ble korreksjonseffekten betydelig forbedret, 312% av VX-809 + VX-770 ΔIscForskolin korreksjon (gjennomsnittlig ΔIscForskolin fold økning på 9,0 ± 4,1, p < 0,05 vs. VX-809 + VX-770) og 372 % av ΔIscCFTRinh172 (gjennomsnittlig reduksjon på ΔIscCFTRinh172 på 15,5 ± 10,5, p < 0,05 vs. VX-809 + VX-770).
Figur 1: Differensieringsmarkører i HNE-kulturer. Representative konfektmikroskopibilder av immunfluorescerende farging av CFTR (grønn), Zona-Occludens-1 (ZO-1, rød), alfa-tubulin (grønn), Muc5AC (rød) og cytokeratin 8 (K8, grønn) i wild-type (WT) (første panel) og F508del (paneler 2 -4) HNE celler dyrket ved luft-væske grensesnitt i 3 uker. Nuclei var farget blå med DAPI. Projeksjoner av kondole mikroskopibilder, toppvisning (øvre paneler) og sidevisning (nedre paneler) av tredimensjonale (3D) Z-stabler rekonstitueringer. Skalastang (20 μm) gjelder både øvre og nedre paneler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekt av frysing på CFTR-relatert cl-sekresjon i HNE-celler . Oppsummering av kortslutningsstrømopptak (Isc) (gjennomsnittlig ± SD) i HNE-kulturer avledet fra F508del/F508del-pasienter og vokst ved luftvæskegrensesnitt i 3 uker. Celler ble behandlet i 48 timer med kjøretøy alene (DMSO) eller VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) i friske (lysegrå, pasientavledede HNE-celler fra 78 pasienter) eller frosset-tint (mørkegrå, pasientavledede HNE-celler fra 9 pasienter). Data representerer gjennomsnittlig (± SD) respons på akutt tilsatt (A) Forskolin (10 μM)/3-isobutyl-1-metylxanthine (IBMX, 100 μM), ΔIscForskolin eller (B) CFTR-hemmer inh172 (5 μM) ΔIscCFTRinh172. Minst to filtre ble analysert per pasient og per tilstand. Stjerner indikerer den statistiske forskjellen mellom korrigerere og kontroll (DMSO-behandlet) * p < 0,05 (uparret t-test). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Korrigering av CFTR-funksjon ved hjelp av doble terapier. Oppsummering av kortslutningsstrømopptak (Isc) (gjennomsnittlig ± SD) i HNE-kulturer avledet fra 10 F508del/F508del-pasienter og vokst ved luftvæskegrensesnitt i 3 uker (kombinerte resultater fra både friske og frosne opptinte kulturer). Celler ble behandlet i 48 timer med kjøretøy alene (DMSO); VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) eller VX-661 (3μM) + VX-770 (100 nM). Data representerer gjennomsnittlig (± SD) respons på akutt tilsatt (A) Forskolin (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIscForskolin eller (B) CFTR-hemmer inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172. Minst to filtre ble analysert per pasient og per tilstand. Stjerner indikerer en statistisk forskjell mellom korrigerere og kontroll (DMSO-behandlet) ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 (Wilcoxon matchet par signert rangeringstest). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effektivitet av trippelterapi vs. dobbeltbehandling på CFTR-korreksjon. Oppsummering av kortslutningsstrømopptak (Isc) (gjennomsnittlig ± SD) i HNE-kulturer avledet fra 6 F508del/F508del-pasienter og vokst ved luftvæskegrensesnitt i 3 uker (kombinerte resultater fra både friske og frosne celler). Celler ble behandlet i 48 timer med kjøretøy alene (DMSO); VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM); ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM); eller VX-661 (3 μM) + VX-445 (3 μM) + VX-770 (100 nM). Data representerer gjennomsnittlig (± SD) respons på akutt tilsatt (A) Forskolin (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIscForskolin eller (B) CFTR-hemmer inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172. Minst to filtre ble analysert per pasient og per tilstand. Stjerner indikerer en statistisk forskjell mellom behandlinger. * p < 0,05 (Wilcoxon matchet par signert rangeringstest). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Mediekomponent | Endelig konsentrasjon |
| FORSTERKNINGSMEDIUM | |
| Avansert DMEM/F-12 Næringsblanding | 86% |
| Fetal Bovine Serum | 10% |
| Penicillin | 100 U/ml |
| Streptomycin | 100 μg/ml |
| Tazocillin | 10 μg/ml |
| Amfotericin B | 2,5 μg/ml |
| Colimycin | 16 μg/ml |
| Ciprofloxacin | 3 μg/ml |
| Hydrocortisone | 0,2 μM |
| Insulin | 5 μg/ml |
| Adrenalin | 0,5 μg/ml |
| EGF | 10 ng/ml |
| Y-27632 (Rho-assosiert kinasehemmer) | 10 μM |
| LUFT-VÆSKE MEDIUM | |
| Avansert DMEM/F-12 Næringsblanding | 94% |
| UltroserG | 2% |
| Penicillin | 100 U/ml |
| Streptomycin | 100 μg/ml |
| Tazocillin | 10 μg/ml |
| Amfotericin B | 2,5 μg/ml |
| Colimycin | 16 μg/ml |
| BERIKET FRYSEMEDIUM | |
| F12 Næringsblanding | 77% |
| HEPES | 3% |
| Fetal Bovine Serum | 10% |
| DMSO | 10% |
Tabell 1: Forsterkning, luftvæske og beriket frysemiddelsammensetning. Liste over reagenser og tilsvarende endelige konsentrasjoner.
| Lengde på bevaring av nesebørste før såing (n = 78) | |
| Dager før såing | Suksessrater (%) |
| 0 | 83 |
| 1 | 84 |
| 2 | 67 |
| 3 | 100 |
| 4 | 89 |
| 5 | 100 |
| 7 | 0 |
| Utfall fra den samme innledende nesebørsten dyrket under både friske og frosne opptinte forhold (n = 13) | |
| Utfall under friske forhold | Suksessrater ved frysetining (%) |
| suksess | 83 |
| fiasko | 29 |
| Virkningen av celletallet på suksessrater (n = 36) | |
| Antall celler per kryo toårig | Suksessrater ved frysetining (%) |
| <2 x 106 | 20 |
| 2–3 x 106 | 50 |
| 3–4 x 106 | 67 |
| >4 x 106 | 79 |
Tabell 2: Parametere som påvirker suksessratene i ferske og frosne HNE-cellekulturer. Suksessrater ble definert som nesebørster som vellykket utvidet og differensiert til et pseudo-stratifisert epitel etter 3 uker ved luftvæskegrensesnittet og presenterte en TEER høyere enn 200 Ω·cm2. Før sådd ble prøver sendt ved romtemperatur i spylemedium med antibiotika. Resultatene representerer data fra 78 ferske prøver og 36 frosne tinede prøver. 13 nesebørster ble analysert under både friske og frosne tinte forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruk av pasientavledede neseepitelceller som surrogater for humane bronkiale epitelceller (HBE) for å måle CFTR-aktivitet i sammenheng med persontilpasset medisin er foreslått som HNE reproduserer cellenes egenskaper i kultur 9,11. Den sterke fordelen med HNE over HBE cellekulturer er at de er lett og ikke-invasivt samplet. Kortslutningsstrømmålinger i HNE-cellekulturer muliggjør vurdering av CFTR-avhengig Cl-transport på tvers av epitelet, som ble vist å korrelere betydelig med CFTR in vivo-aktivitet vurdert av nasal potensiell forskjell hos pasienter med ulike genotyper9. Redning av CFTR-aktivitet i HNE-celler ved VX-809-behandling også signifikant korrelert med forbedringen av klinisk utfall FEV1 hos lumacaftor-ivacaftor behandlet F508del homozygote pasienter12.
Det er viktig at denne studien viser at nyhøstede HNE-celler lett tåler transport og standard fraktforhold, (dvs. de overlever 72 timer ved romtemperatur) noe som gjør det mulig å teste pasientens celler som stammer fra ulike geografiske steder. De kritiske faktorene for vellykket kultur er hovedsakelig kvaliteten på nesepussing og antall levende celler ved prøvetaking. En rekke protokoller har blitt publisert om dyrking og differensiering av HNE cellekulturer; noen uten betinget omprogrammering i ekspansjonsfasen 13,14,15,16,17,18,19,20, noen med betinget omprogrammering i mater 9,11,12,21,22,23,24,25 , 26 eller materfri 5,8,27,28,29 forhold, og flere sammenligner forskjellige metoder 7,8. De tillater alle å skaffe et relativt stort antall ALI-kulturer med riktig differensiering og polarisering, samt gode TEER-verdier. I likhet med denne studien, mange brukte kryopreserverte HNE celler frosset ved passasje 113,28. Interessant nok rapporterer flere forfattere at ROCKi kan forbedre overlevelsen etter kryopreservering når de legges til post-tining kulturmediet og øke antall celler som forblir festet 5,29, noe som tyder på at forsterkningsmediet som brukes i denne studien er spesielt egnet for kryopreservering.
Her viser studien at HNE-celler kan biobankes, den kritiske faktoren er igjen kvaliteten på nesebørsten. En god sammenheng mellom utfallet av ferske prøver og frosne tinte er vist, noe som tyder på at for å optimalisere kvaliteten på HNE-celler som skal biobankes for videre studier, kan en foreløpig studie utføres på ferske prøver hvis de ikke oppnår riktig ALI-differensiering og akseptabel TEER-verdi; en ny nesebørste ville være å foretrekke i stedet for å fryse celler som har stor sannsynlighet for dårlig resultat. En annen kritisk faktor for kryopreservering er cellenummer. i kulturforholdene som brukes i denne studien, når mindre enn 2 x 106 celler er frosset per kryolege, er feilfrekvensen svært høy. Frysing av minst 3 x 106 celler per kryo toårig anbefales.
Resultatene i denne studien tyder på at frysetining ikke endrer HNE-cellenes elektrofysiologiske egenskaper eller respons på CFTR-modulatorer betydelig. Utvalget av tiltak i HNE cellekulturer fra samme F508del-homozygote pasient oppnådd uten frysing eller etter opptining var ikke forskjellig ved VX-809 + VX-770 behandling. Lignende resultater ble tidligere rapportert for HBE-celler der Forskolin-stimulert Isc var stabil etter flere tinings-/kultursykluser av ikke-behandlede F508del-celler30. Dette gir bevis på at HNE-celler kan fryses og lagres i en biobank og studeres senere.
Et økende antall studier viser at HNE cellekulturer kan brukes til å teste effekten av ulike terapier i sammenheng med personlig medisin. Analysen viste at doble terapier som kombinerer en korrigerer med en potensierer alle har sammenlignbar korreksjonseffekt for CFTR-avhengig Cl-sekresjon i F508del-homozygote HNE-celler. Imidlertid ble det lagt merke til en viktig interpatient variasjon, som bekreftet publiserte resultater 9,12,20,25. VX-445 + VX-661 + VX-770 tredoblet korrigering av CFTR-aktivitet sammenlignet med VX-809 + VX-770. Et lignende korreksjonsnivå av F508del-CFTR i HNE-celler ved trippelkombinasjon ble også observert av Laselva et al.28. Som rapportert av Veit et al.26, korrigering av Cl-kanalfunksjon på VX-445 + VX-661 + VX-770-behandling var enda høyere, og nådde 62% av gjennomsnittlig WT-CFTR-aktivitet (område på 19-36 μA / cm2 i korrigert F508del-HNE og 14-50 μA / cm2 i WT-HNE)26.
HNE-cellekulturer tjente også til å teste effekten av CFTR-modulatorer for andre klasse II-mutasjoner. En viktig forbedring av CFTR-aktivitet på VX-445 + VX-661 + VX-770 ble observert i HNE ALI-kulturer som huser G85E / G85E, V520F/1717-1G>A, Y569/Y569D, M1101K/M1101K og N1303K/N1303K genotyper26. På samme måte viste Laselva et al.28 en betydelig korreksjon av CFTR med mutasjoner av M1101K og N1303K, men ingen signifikant korreksjon i G85E HNE-celler. Galapagos/AbbVie korrigerere ble evaluert for disse lumacaftor-ivacaftor-resistente mutantene31. AbbVie-korrigerer AC2-1 og spesielt bikorrigerer AC1+AC2-1 forbedret effektivt Cl-sekresjon i M1101K- og G85E HNE-celler, mens N1303K avledede celler ble korrigert ved en kombinasjon av AC1+AC2-2.
Mål på CFTR-aktivitet i HNE-celler er lovende prekliniske biomarkører prediktive for pasientens respons på testet behandling. Bevis på at fryse-tining sykluser ikke endre korreksjonsnivået gir bevis på at disse cellene kan biobankes og brukes som et kraftig verktøy i sammenheng med personlige medisinprogrammer. En unik nesepussing kan derfor gi tilstrekkelig materiale til å sammenligne legemiddeleffekt, og pasientens HNE-celler kan tines etter hvert som nye legemidler blir tilgjengelige uten behov for å ta nytt ut av pasientene; Dette er spesielt interessant hos spedbarn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen konkurrerende økonomiske interesser knyttet til denne publikasjonen eller vitenskapelig videoproduksjon.
Acknowledgments
Vi takker alle pasienter og deres familier for deltakelse i studien. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra den franske foreningen Vaincre la Mucoviscidose; French Association ABCF 2 og Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
- Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
- Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
- Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
- McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
- Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
- Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
- Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
- Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
- Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
- Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
- Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, Clifton, N.J. 39-54 (2011).
- Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).
