Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

תא בודד לשימוש חוזר לניתוחים אפיגנומיים איטרטיביים

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63456
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חד-תאית לאנליזות אפיגנומיות איטרטיביות באמצעות תא בודד לשימוש חוזר. התא הבודד הניתן לשימוש חוזר מאפשר ניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד ותיקוף סטטיסטי של התוצאות.

Abstract

ניתוחי אפיגנום חד-תאיים נוכחיים מיועדים לשימוש חד-פעמי. התא מושלך לאחר שימוש יחיד, מה שמונע ניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים בתא בודד ודורש נתונים מתאים אחרים כדי להבחין בין אות לרעשי רקע ניסיוניים בתא בודד. מאמר זה מתאר שיטה לשימוש חוזר באותו תא בודד לצורך אנליזות אפיגנומיות איטרטיביות.

בשיטה ניסיונית זו, חלבונים תאיים מעוגנים תחילה לפולימר פוליאקרילאמיד במקום להצליב אותם לחלבון ולדנ"א, ובכך להקל על הטיה מבנית. שלב קריטי זה מאפשר ניסויים חוזרים ונשנים עם אותו תא בודד. לאחר מכן, פריימר אקראי עם רצף פיגום לקשירת קרבה מחושל לדנ"א הגנומי, והרצף הגנומי מתווסף לפריימר על ידי הרחבה באמצעות DNA פולימראז. לאחר מכן, נוגדן כנגד סמן אפיגנטי ובקרת IgG, שכל אחד מהם מסומן בבדיקות DNA שונות, קשורים למטרות בהתאמה באותו תא בודד.

קשירת קרבה נוצרת בין הפריימר האקראי לבין הנוגדן על ידי הוספת DNA מחבר עם רצפים משלימים לרצף הפיגום של הפריימר האקראי ובדיקת הנוגדן-DNA. גישה זו משלבת מידע נוגדנים ורצפי גנום סמוכים בתוצר DNA יחיד של קשירת קרבה. על ידי הפעלת ניסויים חוזרים עם אותו תא בודד, שיטה זו מאפשרת עלייה בצפיפות הנתונים מתא נדיר וניתוח סטטיסטי באמצעות נתוני IgG ונוגדנים בלבד מאותו תא. התאים הבודדים לשימוש חוזר שהוכנו בשיטה זו יכולים להיות מאוחסנים לפחות מספר חודשים ונעשה בהם שימוש חוזר מאוחר יותר כדי להרחיב את האפיון האפיגנטי ולהגדיל את צפיפות הנתונים. שיטה זו מספקת גמישות לחוקרים ולפרויקטים שלהם.

Introduction

טכנולוגיית התא הבודד נכנסת לעידן המולטיומיקס החד-תאי, המשלב טכנולוגיות אומיקס בודדות של תא בודד1. לאחרונה, תעתיק תא בודד שולב עם שיטות לזיהוי נגישות כרומטין (scNMT-seq2 ו- SHARE-seq3) או שינויים בהיסטון (Paired-seq4 ו- Paired-Tag5). לאחרונה, שעתוק חד-תאי ופרוטאומיקה שולבו עם נגישות הכרומטין (DOGMA-seq6). שיטות אלה משתמשות בתיוג מבוסס טרנספוזאז לאיתור נגישות כרומטין או שינויים בהיסטון.

גישות מבוססות טרנספוזאז קוטעות את הדנ"א הגנומי ומוסיפות ברקוד DNA בקצה מקטע הדנ"א הגנומי. כל מקטע גנומי שסוע יכול לקבל רק עד שני ברקודים של דנ"א (= סימן אפיגנטי אחד לכל אתר מחשוף), והדנ"א הגנומי באתר המחשוף אובד. לכן, לגישות מבוססות מחשוף יש פשרה בין מספר הסימנים האפיגנטיים שנבדקו לבין צפיפות האות. זה מעכב את הניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד. שיטה אפיגנומית חד-תאית שאינה מנתקת את הדנ"א הגנומי פותחה כדי להתגבר על בעיה זו 7,8.

בנוסף לנושא שמקורו במחשוף שהוזכר לעיל, לגישות מבוססות טרנספוזאז יש מגבלות נוספות. בניתוח אפיגנום של תא יחיד, חיוני לדעת את מיקומם של היסטונים וחלבונים הקשורים לדנ"א על הגנום. בגישות הנוכחיות, זה מושג על ידי שימוש בתאים בודדים לא קבועים ושימור אינטראקציות חלבון-דנ"א וחלבון-חלבון. עם זאת, זה יוצר הטיה חזקה לאזורי כרומטין נגישים, אפילו בניתוח של שינויים היסטון 9. ניתן לשמר את מיקומם של היסטונים וחלבונים הקשורים לגנום על הגנום ללא קישור בין חלבון-דנ"א לחלבון-חלבון, באמצעות פיגום פוליאקרילאמיד 7,8. גישה זו מפחיתה את ההטיה המבנית שנצפתה בגישות הנוכחיות התלויות באינטראקציות חלבון-דנ"א וחלבון-חלבון.

גישות מבוססות טרנספוזאז יכולות לקבל אותות רק פעם אחת מתא יחיד. לכן, קשה להגדיר את האפיגנום המלא של תא בודד עקב ירידת האותות. תאים בודדים לשימוש חוזר פותחו כדי להתגבר על המגבלות הנוכחיות על ידי מתן אפשרות לניתוח אפיגנומי איטרטיבי באותו תא בודד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: ייצוג סכמטי של השיטה מוצג באיור 1.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה של הפרוטוקול. שלבים 7.2-13 מוסברים באמצעות ייצוגים סכמטיים. כל שורה מציינת שלב בפרוטוקול. חלבון תאי בצבע ירוק הוא נוקלאוזומים אנושיים הנוצרים על בסיס מבנה גבישי (PDB: 6M4G). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. שיווי משקל של עמודות התפלה

הערה: עמודות ספין התפלה משוות כמתואר בשלבים הבאים. עמודות ההתפלה המשוות משמשות בשלבים 2.1, 3.4 ו- 4.6.

  1. הסר את הסגירה התחתונה של עמודת התפלה (חיתוך 7 kDa , נפח חרוזי שרף 0.5 מ"ל, ראה טבלת חומרים) ושחרר את המכסה בחלק העליון של עמודת ההתפלה.
  2. הניחו את העמוד בצינור חלבון בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל (צינור איסוף, ראו טבלת חומרים) ובצנטריפוגה במשקל של 1,500 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להסיר את תמיסת האחסון בעמודה.
    הערה: השתמש בצנטריפוגת רוטור נדנדה כדי לשטח את החלק העליון של מיטת החרוזים.
  3. הסר את הזרימה בצינור 1.5 מ"ל והוסף 300 μL של 150 mM NaCl/100 mM חיץ פוספט, pH 8.0 (ראה טבלה 1), על גבי מצע השרף.
  4. צנטריפוגה במשקל 1,500 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ולהסיר את הזרימה בצינור האיסוף.
  5. חזור על שלבים 1.3-1.4 שלוש פעמים נוספות.
  6. מחק את המאגר מצינור האיסוף והנח את העמוד בצינור איסוף חדש.
  7. השתמש בעמודת ההתפלה המאוזנת בשלבים 2.1, 3.4 ו- 4.4.

2. החלפת חיץ של נוגדנים

הערה: הסר גליצרול, ארגינין ונתרן אזיד מאנטי-H3K27ac 10, אנטי-H3K27me3 10, אנטי-Med111 ואנטי-Pol II10 (ראה הרכב חיץ המוצג בטבלה 1). כל ההליכים הבאים מבוצעים תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעה

  1. יש למרוח את תמיסת הנוגדנים (100 μL, ראה טבלה 2) על עמודת התפלה מאוזנת שהוכנה לאחר שלב 1.
  2. צנטריפוגה ב 1,500 × גרם למשך 2 דקות ב 4 ° C ולהעביר את הזרימה מצינור האיסוף לצינור חלבון 1.5 מ"ל קישור נמוך.
  3. מדוד את ריכוז IgG באמצעות ספיגה של 280 ננומטר12 (השתמש בספקטרופוטומטר מיקרו-נפח).
  4. העבירו את תמיסת הנוגדנים לקסטת אולטרה-סינון (חיתוך משקל מולקולרי 100 kDa, 0.5 מ"ל, ראו טבלת חומרים) ולצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
  5. מדוד את ריכוז IgG באמצעות ספיגה של 280 ננומטר.
  6. חזור על שלבים 2.4-2.5 עד ריכוז IgG מגיע 1 מ"ג / מ"ל.

3. הפעלת נוגדנים

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 2.5 שעות

  1. להמיס 1 מ"ג של succinimidyl 6-hydrazinonicotinate אצטון הידרזון (S-HyNic, ראה טבלה של חומרים) עם 100 μL של N,N-dimethylformamide נטול מים (DMF, ראה טבלה של חומרים).
    הערה: DMF הוא ממס אורגני דליק ורעל כבד רב עוצמה הנספג דרך העור. יש ללבוש כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.
  2. הוסף 0.6 μL של S-HyNic/DMF ל 100 μL של תמיסת הנוגדנים (1 מ"ג / מ"ל ב 150 mM NaCl / 100 mM נתרן פוספט, pH8.0. ראה טבלה 2 עבור נוגדנים בשימוש ובקרת IgG.
  3. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים (הגנה מפני אור).
  4. יש למרוח 100 μL של נוגדן S-HyNic-reacted על החלק העליון של עמודת ההתפלה המאוזנת (ראה שלב 1) ולצנטריפוגה ב-1,500 × גרם למשך 2 דקות ב-4°C כדי לאסוף את הדגימה.
  5. יש להשליך את עמודת ההתפלה לאחר השימוש.
    הערה: היציבות של קבוצות HyNic על חלבונים וביומולקולות אחרות משתנה. מומלץ להצמיד ביומולקולות HyNic-modified באופן מיידי.

4. הפעלת בדיקת DNA

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 2.5 שעות

  1. להמיס גלולה של בדיקת DNA מהונדסת אמין עבור נוגדנים או בקרת IgG (בדיקת נוגדנים, טבלה 3) עם 20 μL של 150 mM NaCl / 100 mM מאגר נתרן פוספט, pH 8.0.
    הערה: חפש כדור/סרט דק ושקוף בתחתית הצינור. יש למרוח את החיץ ישירות על הכדורית. אם הגלולה אינה נראית לעין, ייתכן שהגלולה התנתקה ונדבקה לקיר או למכסה. במקרה זה, צנטריפוגה את הצינור ולחפש גלולה בתחתית הצינור.
  2. להמיס 1 מ"ג של succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB, ראה טבלה של חומרים) עם 50 μL של DMF נטול מים, ולהוסיף 10 μL של DMF לבדיקת נוגדנים מומס.
  3. יש להוסיף 4 μL של S-4FB/DMF שהוכן בשלב 4.2, לערבב ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים (הגנה מפני אור).
  4. החל 34 μL של בדיקת נוגדנים מגיבים S-4FB על החלק העליון של עמודת ההתפלה המאוזנת (ראה שלב 1).
  5. יש למרוח 15 μL של 150 mM NaCl/100 mM חיץ נתרן פוספט, pH 8.0, על החלק העליון של מצע הג'ל לאחר שהדגימה נספגה במלואה, וצנטריפוגה ב 1,500 × גרם למשך 2 דקות ב 4 °C כדי לאסוף את בדיקת נוגדנים S-4FB.
  6. השתמש בזרימה עבור הצמידות הבאה; למדוד את הספיגה ב 260 ננומטר; ולחשב את שיעור ההחלמה של בדיקת הנוגדנים.

5. צימוד של נוגדן S-HyNic-modified ובדיקת נוגדנים S-4FB שונה

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעתיים

  1. ערבבו את הנוגדן S-HyNic-modified ואת בדיקת הנוגדנים S-4FB-modified, והפייטו את התמיסה למעלה ולמטה כדי לערבב.
  2. יש לדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר (הגנה מפני אור).
  3. כדי להרוות את התגובה, הוסף 478.8 μL של פתרון מרווה ואחסון (ראה טבלה 1).
  4. העבר את תמיסת הנוגדנים המצומדים לקלטת אולטרה-סינון (חיתוך משקל מולקולרי של 100 kDa).
  5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 12,000 × גרם, 4 ° C.
  6. בדוק את עוצמת הקול של התמיסה בתוך הקלטת על ידי pipetting.
  7. חזור על שלבים 5.5-5.6 עד שהנפח מגיע ל -100 μL ואחסן ב -20 ° C.
    הערה: ריכוז IgG נמדד על ידי כריך ELISA13,14,15 באמצעות תקן IgG.

6. הכנת חרוזים מגנטיים ליבה

הערה: בשיטה זו, תא בודד מוטבע בתוך חרוז אקרילאמיד דו-שכבתי (ראה איור 2). הליבה היא חרוז פוליאקרילאמיד מגנטי. השכבה החיצונית היא פוליאקרילאמיד בלבד. חרוזי הליבה המגנטיים נוצרים בסעיף זה. סעיף זה אינו חיוני לניסוי. זמן: 3 שעות

Figure 2
איור 2: מבנה של חרוז פוליאקרילאמיד דו-שכבתי לנראות וטיפול קל בניסויי REpi-seq . (A) ננו-חלקיקים מגנטיים משלב 6.6 לאחר צנטריפוגה. הננו-חלקיקים המגנטיים משתנים עם אקרילאמיד מונומרי ומשולבים בחרוז המגנטי פוליאקרילאמיד המוצג ב-B. (B) ייצוג סכמטי של תא בודד לשימוש חוזר עם חרוז מגנטי פוליאקרילאמיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. יש לערבב 50 μL של 1 M סודיום ביקרבונט, pH 8.5, ו 450 μL של 40% תמיסת אקרילאמיד.
    הערה: אקרילאמיד הוא רעלן עצבי. יש ללבוש כפפות, מגן עיניים ומעיל מעבדה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.
  2. יש להשהות 1 גרם של אבקת תחמוצת ברזל 30 ננומטר אסטרית של NHS (ראה טבלת החומרים) במאגר האקרילאמיד/נתרן ביקרבונט ולדגור ב-4°C למשך הלילה.
    הערה: מכיוון שחרוזי אקרילאמיד שקופים, ייתכן שיהיה קשה לראות ולתפעל את מיקום החרוזים. הכללת חרוז ליבה עשוי תחמוצת ברזל משפרת את הנראות ומקלה על מניפולציה מכיוון שניתן לשלוט במיקום החרוזים באמצעות מגנט. עם זאת, אם משתמשים מכירים את ניסויי REpi-seq, ניתן לדלג על השימוש בחרוזי פוליאקרילאמיד מגנטיים מרכזיים.
  3. מעבירים את מתלה ננו-חרוז ל-2 צינורות (1.5 מ"ל), צנטריפוגה ב-21,300 × גרם למשך שעה אחת (השתמשו ברוטור זוויתי) ב-4°C, והסירו את הסופרנטנט.
  4. יש להשהות את הבוצה התחתונה עם 1 מ"ל של 40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (19:1, ראה טבלת חומרים).
    הערה: ביס-אקרילאמיד הוא רעלן עצבי. יש ללבוש כפפות ומעיל מעבדה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.
  5. צנטריפוגה ב 21,300 × גרם למשך שעה אחת (השתמש ברוטור זוויתי) ב 4 ° C.
  6. צנטריפוגה ב-5,000 × גרם למשך 30 דקות (השתמש ברוטור נדנדה ללא בלם) ב-4°C.
  7. הסר את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה P1000 עם שאיפה במהירות איטית.
  8. כוונן את עוצמת הקול ל-400 מיקרוליטר של 40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (19:1, ראה טבלת חומרים).
  9. הוסף 25 μL של 10% תמיסת אמוניום פרסולפט (ראה טבלה 1).
    הערה: אמוניום פרסולפט הוא חומר מחמצן חזק. אבק הנישא באוויר המכיל אמוניום פרסולפט עלול לגרות את העיניים, האף, הגרון, הריאות והעור במגע. יש ללבוש כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.
  10. כדי ליצור חרוזי פוליאקרילאמיד מגנטיים ליבה, העבר 0.5 μL של תרחיף תחמוצת הברזל שעבר שינוי אקרילאמיד לצינור PCR.
  11. יש להוסיף 50 μL של 4% N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine/mineral oil (TEMED, ראו טבלה 1) ולדגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    הערה: TEMED הוא ממס דליק. עבודה מתחת למכסה מנוע. אין לשאוף. יש להרחיק מאש גלויה, משטחים חמים ומקורות הצתה. יש ללבוש כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.

7. שינוי קבוצת האמינו של חלבונים תאיים עם אקרילאמיד מונומר

הערה: REpi-seq תוכנן לנתח את האפיגנום של תאים עכבריים ואנושיים ברמת התא היחיד. כל שלב חייב להיות מותאם בעת שימוש בשיטה זו על תאים של מינים שאינם עכבר או אדם.

  1. קצירת התאים
    הערה: זמן: 30 דקות
    1. מדוד את ריכוז התא ואת הכדאיות שלו באמצעות מונה תאים (ראה טבלת חומרים).
      הערה: הכדאיות של התאים בשלב זה משפיעה על מספר התאים החיים בניתוח הנתונים.
    2. יש להתאים את ריכוז התאים ל-1 × 105 תאים/מ"ל עם מדיום תרבית (*) המכיל 10% נסיוב בקר עוברי.
      הערה: *מדיום התרבות הוא מדיום תרבית אופטימלי לתאי העניין.
    3. העבר 1 מ"ל של תרחיף התא לצינור 1.5 מ"ל.
    4. צנטריפוגה את מתלה התא ב 240 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
    5. הוסף 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), לערבב את התאים על ידי pipetting עדין, וצנטריפוגה את תרחיף התא ב 240 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    6. הסר את supernatant.
      הערה: יש לבצע את כל השלבים הנ"ל במכסה מנוע נקי לזרימה למינרית כדי למנוע זיהום.
  2. שינוי קבוצת האמינו של חלבונים סלולריים עם אקרילאמיד מונומרי
    הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעה וחצי
    1. הוסף 1 מ"ל של תמיסת שינוי קבוצת אמינו (ראה טבלה 1) לגלולת התא והשהה את גלולת התא על ידי פיפטינג עדין.
    2. לדגור את הצינור על קרח במשך 1 שעה צנטריפוגה את התא השעיה ב 240 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את התאים עם 100 מ"ל של 4% אקרילאמיד/1 מ"מ EDTA/PBS המכילים צבע אינטרקלטור לדנ"א (ראה טבלה 1, תא 1/μL).

8. הכנת תאים בודדים לשימוש חוזר

  1. הכנת תאים בודדים לשימוש חוזר (גרסה ידנית)
    הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 9 שעות/96 תאים
    1. ערבבו 1 מ"ל של תרחיף התא (1 תא/μL) ו-199 מ"ל של 1 mM EDTA/PBS המכיל צבע אינטרקלטור לדנ"א (ראו טבלה 1).
    2. מעבירים 200 μL של תרחיף התא לכל באר של לוחות שטוחים בעלי 96 בארות (סה"כ 10 לוחות, ראה טבלת חומרים).
    3. הניחו את הכיסוי על לוח 96 הקידוחים וסרקו את 10 הלוחות באמצעות מיקרוסקופ סורק (ראו טבלת חומרים) כדי לזהות בארות המכילות תא בודד.
    4. להעביר את התוכן של הבאר המכילה תא בודד לצינור PCR.
      1. הטו את הצלחת (לכיוון המפעיל), והמתינו מספר דקות עד שהתא הבודד שקע לקצה התחתון של הבאר.
      2. מניחים את קצה הפיפטה בפינה התחתונה ומעבירים את התא הבודד ואת המאגר (שואפים 210 μL/well = 200 μL של חיץ + 10 μL אוויר) לצינור PCR.
        הערה: הקפד להשתמש בטיפ P200 לשמירה נמוכה.
      3. בדוק את הבאר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר את ההעברה.
      4. אם תא בודד עדיין נמצא בבאר, הוסף 200 μL/well של 1 mM EDTA/PBS המכיל צבע אינטרקלטור עבור DNA.
      5. לאחר מכן, חזור על ההעברה.
    5. צנטריפוגה את צינור ה- PCR ב 240 × גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות רוטור נדנדה ללא בלם.
      הערה: בלימה גורמת לזרימה מסתחררת של מים בצינור, אשר משבשת את המשקעים של התא הבודד. בעת צנטריפוגה עם רוטור מתנדנד ללא בלם, התא היחיד תמיד ישקע לתחתית הצינור. עם זאת, אם נעשה שימוש ברוטור זוויתי, התא היחיד מתחבר לדופן הצד של צינור ה- PCR ועלול ללכת לאיבוד.
    6. הסר 195 μL של supernatant עם מהירות pipetting איטית מאוד.
    7. הוסף 195 μL/צינור של תמיסת אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד/APS (ראה טבלה 1).
    8. צנטריפוגה צינור PCR ב 240 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות רוטור נדנדה ללא בלימה.
    9. הסר 195 μL של supernatant עם מהירות pipetting איטית מאוד.
    10. העבירו את 3 μL התחתונים לצינור PCR המכיל 4% TEMED/שמן מינרלי וחרוז פוליאקרילאמיד מגנטי (שנוצר בשלב 6).
      הערה: הקפד להשתמש בטיפ P10 לשמירה נמוכה. מוציאים את התא ליד חרוז הפוליאקרילאמיד המגנטי. בשמן המינרלי, הנוזל המכיל את התא היחיד נצמד לפני השטח של חרוז פוליאקרילאמיד מגנטי על ידי מתח פני השטח.
    11. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: תהליך זה יוצר חרוז ג'ל אקרילאמיד דו-שכבתי. הליבה היא חרוז ג'ל מגנטי. השכבה החיצונית היא ג'ל פוליאקרילאמיד המכיל תא בודד. התא היחיד מוטבע בשכבה החיצונית של הג'ל. נקודת עצירה בטוחה: לאחר שטיפת התאים הבודדים הניתנים לשימוש חוזר עם 50% גליצרול/1 mM EDTA/0.05% Tween 20/0.5% BSA/TBS, ניתן לאחסן את התאים הבודדים הניתנים לשימוש חוזר בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים.
  2. הכנת תאים בודדים לשימוש חוזר (גרסה חצי אוטומטית)
    הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 3 שעות / 96 תאים
    1. ערבבו 1 מ"ל של תרחיף תאים (1 תא/μL) ו-199 מ"ל של 1 mM EDTA/PBS המכיל צבע אינטרקלטור לדנ"א (ראו טבלה 1).
    2. העבירו 200 μL של תרחיף התא לכל באר של צלחת ננו-באר 4 nL (ראו איור 3 וטבלת החומרים) והניחו את צלחת הננו-באר 4 nL על רובוט אוטומטי לאיסוף חד-תאי (ראו טבלת חומרים).
    3. הניחו לוחית PCR של 96 בארות כלוחית יעד על הרובוט האוטומטי לבחירה חד-תאית. ודא שכל באר מכילה 200 μL/באר אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד/תמיסת APS (ראה טבלה 1).
    4. העבר תא בודד מננו-באר 4 nL לבאר של צלחת PCR של 96 בארות (ראה וידאו משלים S1).
    5. שים כיסוי על גבי צלחת PCR 96-well וצנטריפוגה את צלחת 96-well ב 240 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות רוטור נדנדה ללא בלם.
    6. הניחו את לוחית ה-PCR בעלת 96 הקידוחים על סיפון רובוט אוטומטי לטיפול בנוזלים (ראו טבלת חומרים, איור 4 וקוד משלים 1).
    7. גרור ושחרר את הקוד המשלים 1 לחלון התוכנה (ראה טבלת חומרים) של הרובוט המטפל בנוזל.
    8. הפעל את התוכנית על הרובוט האוטומטי לטיפול בנוזלים (ראה וידאו משלים S2 ווידאו משלים S3).
      1. הסר 195 μL של supernatant עם מהירות pipetting איטית מאוד.
      2. הוסף 50 μL של 4% TEMED/שמן מינרלי.
        הערה: שלבים 8.2.8.1-8.2.8.2 יכולים להתבצע באמצעות צנרת ידנית.
    9. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר (איור 5). נקודת עצירה בטוחה: לאחר שטיפת התאים הבודדים הניתנים לשימוש חוזר עם 50% גליצרול/1 mM EDTA/0.05% Tween 20/0.5% BSA/TBS, אחסנו את התאים הבודדים הניתנים לשימוש חוזר בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים.

Figure 3
איור 3: ליקוט אוטומטי של תא בודד והעברתו ללוחית PCR של 96 בארות בשלב 8.2 . (A) סקירה כללית של מערכת ליקוט תאים יחידה. רובוט יחיד לקטיף תאים נמצא במכסה מנוע נקי של זרימה למינרית כדי למנוע זיהום. (B) צלחת בת 24 בארות עם 4 ננו-בארות nL בתוך הבאר. (C) התפלגות תאים בבאר מלוח 24 הקידוחים. נקודות ירוקות הן תאים המזוהים כתא בודד בכל ננו-באר 4 nL. נקודות מגנטה הן תאים המזוהים ככפולים או כפולות של תאים. (D) תמונת שדה בהיר של הבאר בלוח של 24 בארות. ריבוע ירוק הוא ננו-באר 4 nL המכיל תא יחיד. ריבוע מגנטה הוא ננו-באר 4 nL המכיל תאים מרובים. (E) שדה מוגדל של כ-4 ננו-בארות nL. נקודות בהירות הן תאים בודדים בננו-בארות 4 nL. מערכת בחירת התא היחיד מזהה ננו-בארות המכילות תא בודד על ידי קבלת תמונות שדה בהיר ופלואורסצנטי של תאים עם צביעת DAPI. תאים בודדים מזוהים מועברים מננו-באר 4 nL לבאר של צלחת PCR של 96 בארות. פסי קנה מידה = 2 מ"מ (C, D), 100 מיקרומטר (E). קיצור = DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: יצירת תאים בודדים לשימוש חוזר באמצעות רובוט לטיפול בנוזלים. (A) סיפון של הרובוט המטפל בנוזלים. הסיפון כולל 11 חריצים למתלים בעלי קצה פיפטה (קצה P300: חריצים 1-3, קצה P20: חריצים 5-6), צלחת 96 בארות עמוקות בעומק 2 מ"ל (חריץ 4), שתי צלחות PCR בעלות 96 בארות המכילות תא בודד לכל באר (חריצים 7 ו-10), ושתי צלחות שטוחות בעלות 96 בארות לפסולת נוזלית (חריצים 8 ו-11). (B) הסיפון לאחר הנחת כלי המעבדה. (C) ייצוג סכמטי של צנרת רובוטית בשלב 8.8.1. התוכנית מסירה את supernatant מבלי לשאוף תא אחד מתחתית צלחת PCR 96-well. (D) תאים בודדים הניתנים לשימוש חוזר הנוצרים באמצעות הקוד המשלים 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

9. חישול פריימר אקראי והארכה

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. כוכביות (*) בשלבים הבאים מציינות כי ניתן להשתמש במפריד מגנטי כדי לשלוט במיקום חרוזי הפוליאקרילאמיד המכילים תא בודד לשימוש חוזר בצינור. עם זאת, השימוש במפריד המגנטי אינו חיוני. על ידי תנועה איטית לאורך קצה הפיפטה לאורך דופן הצינור, החרוזים נדחפים כלפי מעלה לצורך שטיפה או החלפת חיץ. זמן: 10 שעות

  1. הסר את השמן המינרלי על ידי pipetting(*) ושטוף (*) 5 פעמים עם 200 μL של 1x TP Mg(-) חיץ (לדלל 10x TP Mg(-) למאגר 1x עם מים טהורים במיוחד, ראה טבלה 1).
  2. הסר את הסופרנאטנט (*) והוסף 15 μL של חיץ חישול (ראה טבלה 1).
  3. דוגרים במשך שעה על קרח.
    הערה: מטרת הדגירה היא לחלחל את הפלזמה ואת קרומי הגרעין ולהעביר את הפריימר האקראי לגרעין התא.
  4. הניחו את צינורות ה-PCR על מחזור תרמי וחממו ב-94°C למשך 3 דקות.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא כ 20 μL, כולל נפח החרוז polyacrylamide. הטמפרטורה של מכסה מחזור תרמי הוא 105 °C (75 °F).
  5. מעבירים את הצינורות לגוש מתכת מקורר בקרח ודגרים במשך 2 דקות.
  6. הוסף 4 μL של תערובת MgSO4/NaCl/dNTP (ראה טבלה 1) וערבב עם מערבל מערבולת במהירות בינונית.
  7. מוסיפים 1 μL של Bst פולימראז, פרגמנט גדול (ראו טבלת חומרים) ומערבבים באמצעות מערבל מערבולת במהירות בינונית.
  8. יש לדגור במשך 4 שעות על שייקר (600 סל"ד ב-4°C).
    הערה: מטרת הדגירה היא להעביר את Bst פולימראז לגרעין התא.
  9. מקם את צינור ה- PCR במחזור תרמי והפעל אחת מהתוכניות הבאות.
    1. הפעל תוכנית של 4 שעות: 10 ° C במשך 30 דקות, 20 ° C במשך 30 דקות, ו 25 ° C במשך 180 דקות.
    2. לחלופין, הפעל תוכנית לילה: 4 ° C במשך 4 שעות, 10 ° C במשך 2 שעות, 20 ° C במשך 2 שעות, 25 ° C במשך 4 שעות, והחזק ב 4 °C (75 °F).
      הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא כ 25 μL, כולל נפח החרוז polyacrylamide. הטמפרטורה של מכסה המחזור התרמי היא 105 מעלות צלזיוס. נקודת עצירה בטוחה: עצור את הניסוי כאן עד יום אחד על ידי אחסון התאים הבודדים לשימוש חוזר ב 4 ° C.

10. קשירת נוגדנים

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעה וחצי

  1. הוסף 1.625 μL של תמיסת NaCl/EDTA/BSA (ראה טבלה 1) וערבב על-ידי ערבול במהירות נמוכה.
    הערה: שלב זה נועד 1) להקל על כלציה של Mg2+ על ידי EDTA, 2) לייצב את הקישור של פריימר אקראי1 מורחב על ידי 300 mM NaCl, ו 3) לחסום קשירה לא ספציפית של נוגדנים באמצעות אלבומין בסרום בקר (BSA) בתגובה הבאה.
  2. יש לדגור במשך שעה על קרח ולהוסיף 0.1 מיקרוגרם/מ"ל כל נוגדן ולשלוט IgG מצומד עם בדיקת נוגדנים (מוכן בשלב 5).
  3. יש לדגור לילה על קרח עם ניעור עדין על שייקר.

11. קשירת קרבה של בדיקת נוגדנים ופריימר אקראי מורחב קרוב

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. כוכביות (*) בשלבים הבאים מציינות היכן ניתן להשתמש במפריד מגנטי כדי לשלוט במיקום של חרוזי פוליאקרילאמיד המכילים תא יחיד לשימוש חוזר בצינור. עם זאת, השימוש במפריד המגנטי אינו חיוני. על ידי תנועה במורד קצה פיפטה באיטיות לאורך דופן הצינור, ניתן לדחוף את החרוזים כלפי מעלה לצורך שטיפה או החלפת חיץ. זמן: 6 שעות

  1. יש לשטוף (*) פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר TPM-T אחד (20 דקות דגירה בכל כביסה) על קרח. יש לדלל 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/אשלגן כלורי/מגנזיום גופרתי/Triton X-100) ל-1x עם מים טהורים במיוחד).
  2. הסר (*) את הסופרנאטנט ושטוף (*) פעם אחת עם 1x T4 DNA ligase buffer (ראה טבלת חומרים).
  3. הסר (*) את הסופרנאטנט והוסף 19 מיקרוליטר של תמיסת מתאם קשירה (ראה טבלה 1).
  4. לדגור במשך 1 שעה ב 25 ° C.
  5. מוסיפים 1 μL T4 DNA ligase (ראה טבלת חומרים) ומערבבים את הצינור על מערבל מערבולת במהירות בינונית.
  6. הניחו את הצינור על מחזור תרמי והפעילו את התוכנית הבאה: תוכנית קשירת קרבה, 4 שעות ב-16°C ו-30 דקות ב-25°C.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא כ 25 μL, כולל נפח החרוז polyacrylamide. הטמפרטורה של מכסה המחזור התרמי היא טמפרטורת החדר.
  7. יש לשטוף (*) פעמיים לזמן קצר עם 200 μL של מאגר 1x Bst Mg(-) EDTA(+) (ראה טבלה 1; הכן מאגר 1x ממאגר מלאי 10x) ואחסן את התא בטמפרטורה של 4°C, למשך הלילה. נקודת עצירה בטוחה: עצור את הניסוי כאן עד יום אחד על ידי אחסון התאים הבודדים לשימוש חוזר ב 4 ° C.

12. הרחבה מלאה של הפריימר האקראי הראשון

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 4.5 שעות

  1. יש לשטוף פעמיים עם 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(-) buffer (ראה טבלה 1, להכין 1x buffer מ 10x מאגר המלאי), להסיר את supernatant, ולהוסיף 20 μL של תערובת Bst/dNTPs/MgSO4 (ראה טבלה 1).
  2. מערבבים עם מערבל מערבולת במהירות בינונית ודגרים במשך 4 שעות על שייקר מסלולי (ב-6°C וב-500 סל"ד).
  3. הניחו את הצינור על מחזור תרמי והפעילו את התוכנית הבאה: תוכנית הארכה מלאה: 10°C למשך שעה אחת, 20°C למשך שעה אחת, 30°C למשך שעה אחת, 40°C למשך שעה אחת, 50°C למשך שעה אחת, 65°C למשך שעה אחת, 94°C למשך 10 דקות, והחזיקו בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי כאן למשך עד יום אחד על ידי אחסון התאים הבודדים הניתנים לשימוש חוזר ב- 4 ° C.

13. הגברה של תזוזה מרובה

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעתיים וחצי (שלבים 13.1-13.2) + 15 דקות (שלבים 13.3-13.4) + יום אחד (שלבים 13.5-13.10)

  1. מוסיפים 0.4 μL של פריימר אקראי 2nd 100 μM (ראו טבלה 3) ומערבבים עם מערבל מערבולת במהירות בינונית.
  2. יש לדגור במשך שעתיים ב-6°C וב-500 סל"ד על שייקר מסלולי, ולהניח את הצינור על מחזור תרמי ולחמם ב-94°C למשך 3 דקות.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא כ 25.4 μL, כולל נפח החרוז polyacrylamide. הטמפרטורה של מכסה מחזור תרמי הוא 105 °C (75 °F).
  3. הניחו את הצינורות בגוש מתכת מקורר קרח והוסיפו 1 μL/צינור של Bst DNA פולימראז.
  4. מערבולות במהירות איטית, מניחים את הצינורות על מחזור תרמי, והפעל את התוכנית הבאה:
    טמפרטורה של 4°C למשך 4 שעות, 10°C למשך 30°C, 20°C למשך 30°C למשך 30°, 30°C למשך 30°C, 40°C למשך 30°C למשך 30°, 50°C למשך 30°C למשך 30°C, 65°C למשך 60°, 94°C למשך 3°C והחזק בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא כ 26.4 μL, כולל נפח חרוז polyacrylamide. הטמפרטורה של מכסה המחזור התרמי היא 105 מעלות צלזיוס. נקודת עצירה בטוחה: עצור את הניסוי כאן עד יום אחד על ידי אחסון התאים הבודדים לשימוש חוזר ב 4 ° C.
  5. אספו את הסופרנאטנט (כ-20 מיקרוליטר), והעבירו אותו לצינור PCR.
  6. אחסנו את הסופרנאטנט שנאסף בטמפרטורה של -80°C.
  7. הוסף 20 μL/צינור של 0.05% Tween 20/0.1x TE buffer לצינור PCR המכיל את התא היחיד לשימוש חוזר (ראה טבלה 1) ודגור על התא היחיד לשימוש חוזר ב 4°C, למשך הלילה. נקודת עצירה בטוחה: עצרו את הניסוי כאן למספר ימים על ידי הארכת זמן הדגירה.
  8. אספו את הסופרנאטנט ושלבו את הסופרנאטנט עם הדגימה שנאספה בשלב 13.5.
  9. חזור על שלבים 13.7-13.8 פעם נוספת. השרו את התא הבודד הרב-פעמי ב-50% גליצרול/5 mM EDTA/0.5% BSA/0.05% Tween20/TBS ודגרו עליו במשך 30 דקות על שייקר אורביטלי (4°C, 600 סל"ד). אחסנו את התא הבודד הניתן לשימוש חוזר בטמפרטורה של -20°C עד לניסוי הבא.
  10. הוסף 40 μL של תערובת מאסטר Exo (ראה טבלה 1) והנח את הצינור על מחזור תרמי והפעל את התוכנית הבאה: i) 95 ° C במשך 5 דקות, ii) 95 ° C עבור 30 s, iii) 60 ° C 30 s, iv) 72 ° C עבור 30 s, v) חזור על שלבים ii-iv 19 פעמים, vi) 72 ° C במשך 5 דקות, vii) להחזיק ב 4 ° C.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא כ 45 μL, כולל נפח החרוז polyacrylamide. הטמפרטורה של מכסה המחזור התרמי היא 105 מעלות צלזיוס. נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי כאן לפחות למספר ימים על ידי אחסון הדגימה ב -80 מעלות צלזיוס.

14. טיהור פנול-כלורופורם ומשקעים פוליאתילן גליקול

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעה וחצי

  1. להעביר את המוצר לצינור DNA 0.5 מ"ל קישור נמוך ולהוסיף 100 μL של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל.
    הערה: פנול:כלורופורם:איזואמיל אלכוהול גורם לגירוי ואולי לכוויות במגע. יש ללבוש כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה. יש להשתמש רק עם אוורור מתאים, או ללבוש מכונת הנשמה מתאימה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.
  2. נער במשך 30 שניות ביד וצנטריפוגה ב 12,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  3. אספו את הפאזה המימית (80 μL) לתוך צינור DNA בעל קישור נמוך של 0.5 מ"ל, והוסיפו 40.84 μL/צינור של תערובת אקרילאמיד/MgCl2 ליניארית (ראו טבלה 1).
  4. מוסיפים 47.06 μL/צינור של 50% (w/v) PEG8000 (ללא RNase) ומערבבים על ידי pipetting.
  5. יש לדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 240 × למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. הסר את supernatant ולהוסיף 400 μL / צינור של 80% אתנול (EtOH).
  7. יש לשטוף עם 80% EtOH, להסיר את הסופרנאטנט באמצעות שואף, ולייבש את הכדורית באוויר.
  8. יש להשעות את הגלולה עם 20 μL של 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, pH 7.4 buffer, ולאחסן את התמיסה בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: מדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות צבע אינטרקלטור דו-גדילי ספציפי לדנ"א (ראה טבלת חומרים). נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי כאן בבטחה למשך שבוע לפחות.

15. תמלול חוץ גופי

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase ו- RNase. זמן: 5 שעות

  1. הפשירו DNA של מוצרים שמקורם בתא בודד (משלב 14) והכינו ספרייה מעורבת של מוצרים שמקורם בתא בודד על ידי ערבוב 2 μL לתא של תוצרי הדנ"א (נפח כולל 20 μL).
  2. הוסף 26 μL של תערובת אב לתמלול חוץ גופי (ראה טבלת החומרים ופרוטוקול היצרן) וערבב על ידי פיפט.
  3. הניחו את צינור ה-PCR על מחזור תרמי ודגרו במשך 4 שעות ב-37°C.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח הפתרון הוא 46 μL. הטמפרטורה של מכסה מחזור תרמי הוא 105 °C (75 °F).
  4. הוסף 5 μL של 10x DNase I buffer (ראה טבלת חומרים) והוסף 4 μL של DNase I (ללא RNase, 4 U, ראה טבלת חומרים).
  5. מערבבים ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C, ומעבירים את הדגימה לצינור של 0.5 מ"ל.
  6. הוסיפו 300 μL/צינור של Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (ראו טבלת חומרים) וערבבו במערבולות עדינות.
    הערה: Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform יכול להוביל לכוויות כימיות חמורות במגע. יש ללבוש כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה. יש להשתמש רק עם אוורור הולם או ללבוש מכונת הנשמה מתאימה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.
  7. יש לדגור במשך 5 דקות ב-R.T. על שייקר ולאחר מכן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80°C למשך עד 3 ימים.
    הערה: נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי כאן בבטחה עד 3 ימים.

16. טיהור RNA

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase ו- RNase. זמן: שעתיים

  1. הוסף 80 μL / צינור כלורופורם לדגימה משלב 15.7 ונער את הצינור במרץ ביד במשך 15 שניות.
  2. יש לדגור במשך 2-15 דקות בטמפרטורת החדר ולבצע צנטריפוגות בטמפרטורה של 12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4°C.
  3. לאסוף ולהעביר את השלב המימי של הדגימה (~ 200 μL) לצינור חדש 1.5 מ"ל.
  4. הוסף 600 μL / צינור של Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ולהעביר את הדגימה לצינור 1.5 מ"ל.
  5. הוסף 180 μL / צינור של כלורופורם ונער את הצינור במרץ ביד במשך 15 שניות.
  6. צנטריפוגה הדגימה ב 12,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  7. לאסוף ולהעביר את הפאזה המימית של הדגימה (~ 450 μL) לצינור 1.5 מ"ל.
  8. הוסף 60 μL / צינור של אקרילאמיד ליניארי (5 מיקרוגרם / μL) והוסף 400 μL / צינור של 100% איזופרופנול לשלב המימי.
  9. יש לדגור על הצינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולצנטריפוגה אותו בטמפרטורה של 12,000 × למשך 10 דקות ב-4°C.
  10. מוציאים את הסופרנאטנט בזהירות.
  11. שטפו את גלולת הרנ"א 3 פעמים עם 200 מיקרוליטר של 75% אתנול (מים נטולי EtOH/RNase), הסירו את הסופרנאטנט וייבשו באוויר את כדורית הרנ"א.
    הערה: אין לאפשר לרנ"א להתייבש לחלוטין מכיוון שהגלולה עלולה לאבד את מסיסותה.
  12. יש להשהות מחדש את כדורית ה-RNA ב-20 μL של מים נטולי RNase המכילים מעכב RNAse (1 μL/20 μL) ולהמיס את הגלולה על ידי פיפטינג.
  13. מדוד את הספיגה ב- 260 ננומטר.

17. תמלול הפוך

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעה

  1. הוסף 7 μL / צינור של פריימר שעתוק לאחור + תערובת dNTP (ראה טבלה 1 וטבלה 3) ומניחים את הצינורות על מחזור תרמי.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא 27 μL. הטמפרטורה של מכסה מחזור תרמי הוא 105 °C (75 °F).
  2. מחממים ב-65°C למשך 5 דקות ומניחים את הצינורות על קרח למשך דקה אחת לפחות.
  3. הוסף 14 μL / צינור של תערובת מאסטר שעתוק הפוך (ראה טבלה 1) וערבב על ידי pipetting.
  4. מניחים את הצינורות על מחזור תרמי, ודגרים אותם ב 55 ° C במשך 10 דקות ולאחר מכן ב 80 ° C במשך 10 דקות.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא 60 μL. הטמפרטורה של מכסה מחזור תרמי הוא 105 °C (75 °F).

18. סינתזת גדיל שני

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 2.5 שעות

  1. הוסף 40 μL / צינור של מים טהורים במיוחד ופצל את הפתרון 100 μL לשני צינורות PCR 0.2 מ"ל (50 μL / צינור).
  2. הוסף 60 μL / צינור של תערובת סינתזת גדיל שני (ראה טבלה 1) ומקם את הצינורות על מחזור תרמי והפעל את התוכנית הבאה: i) 95 ° C במשך 5 דקות, ii) 95 ° C עבור 30 s, iii) 60 ° C עבור 30 s, iv) 72 ° C עבור 30 s, v) חזור על שלבים ii-iv 20 פעמים, vi) להחזיק ב 4 ° C.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא 110 μL. הטמפרטורה של מכסה מחזור תרמי הוא 105 °C (75 °F).
  3. יש להוסיף 4.4 μL/צינור של 0.5 M EDTA (20 מ"מ סופי) ולאחסן בטמפרטורה של -80°C, למשך הלילה.
    הערה: נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי כאן בבטחה עד מספר ימים.
  4. טיהור DNA על ידי טיהור פנול-כלורופורם ומשקעים מפוליאתילן גליקול (המתוארים בשלב 14).
    הערה: נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי בבטחה כאן למשך שבוע לפחות.

19. הגבלת עיכול אנזים ובחירת גודל

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 3 שעות (שלבים 19.1-19.7)

  1. למדוד את ריכוז הדנ"א של הדנ"א המטוהר (משלב 18.4) על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר.
  2. העבר 6 מיקרוגרם של DNA לצינור PCR, הוסף 30 μL של 10x חיץ עיכול, ולהתאים את נפח ל 294 μL עם מים טהורים במיוחד.
  3. הוסף 6 μL של אנזים הגבלת BciVI ודגור ב 37 ° C במשך 1 שעות.
  4. בצע משקעי EtOH עם פוליאקרילאמיד ליניארי.
    1. הוסף 60 μL / צינור של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2) ולאחר מכן להוסיף 40 μL / צינור של אקרילאמיד ליניארי (5 מ"ג / מ"ל, ראה את טבלת החומרים).
    2. הוסף 400 μL / צינור של EtOH ודגור לילה ב -20 ° C.
      הערה: נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי כאן בבטחה ליום אחד.
    3. צנטריפוגה 12,000 × גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
    4. שטפו את הגלולה פעמיים עם 80% EtOH וייבשו את הכדור.
    5. ממיסים את הגלולה עם 20 μL של חיץ 1xTE ומוסיפים 4 μL / צינור של חיץ טעינת ג'ל 6x טרי.
  5. טען את הדגימה בג'ל אגרוז 5% / חיץ TAE 0.5x ובצע אלקטרופורזה (50 V למשך 40 דקות).
  6. חתכו ואספו את הג'ל מעל 50 bp (ראו איור 6) וחילצו את הדנ"א באמצעות ערכת מיצוי ג'ל.
    הערה: נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי בבטחה כאן למשך שבוע לפחות.
  7. בניית ספריית הריצוף באמצעות ערכת הכנת ספריית דנ"א (ראה טבלת חומרים)16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

K562 תאים בודדים נוצרו באמצעות הפרוטוקול המתואר בשלב 8 (ראה איור 5). תאים בודדים הוטמעו בשכבה החיצונית של חרוז הפוליאקרילאמיד. הדנ"א של התא הוכתם והודגם באמצעות צבע אינטרקלטור להכתמת DNA.

Figure 5
איור 5: יצירת תאים בודדים הניתנים לשימוש חוזר. תאים מוכתמים בצבע אינטרקלטור עבור DNA (פלואורסצנטיות ירוקה). חיצים לבנים מציינים תאים בודדים המוטבעים בשכבה החיצונית של חרוזי פוליאקרילאמיד. התא הבודד לשימוש חוזר ממוקם בלוח בעל תחתית שטוחה של 96 בארות. התמונות צולמו במיקרוסקופ סורק, BZ-X710. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

התוצאות המוצגות באיור 6 תמכו ביצירת תוצרי הדנ"א הרצויים. תוצרי DNA משלב 19.7 נחתכו על ידי אנזים הגבלת BciVI למקטעים של 19-20 bp, 31-32 bp, 49 bp ו->49 bp. תוצאות אלה תמכו במסקנה שרוב המוצרים מכילים רצפים שמקורם בבדיקת נוגדנים ורצפיםשמקורם בפריימר אקראי שני. מוצרי ה- DNA נקשרו לאחר מכן עם מתאם Illumina באמצעות ערכת TruSeq Nano ורוצפו באמצעות רצף Illumina NovaSeq6000.

Figure 6
איור 6: תוצרי דנ"א לפני ואחרי הגבלת עיכול אנזימים של BciVI. (A) עיכול BciVI יצר את המקטעים הצפויים של 19-20 bp, מקטעים של 31-32 bp, ואת המוצרים הרצויים (>49 bp) המכילים ברקוד נוגדנים, רצף קשירה, DNA גנומי וברקוד תא. (ב) חלוקת גודל המוצרים הסופיים בסוף שלב 19.7. ספריית DNA בנויה נותחה על ידי אלקטרופורזה נימית. הקו הוורוד הבהיר מציין את המוצרים הרצויים המכילים מתאמי ריצוף, ברקוד נוגדנים וברקוד סלולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות הריצוף הצביעו על כך שהמוצרים שנוצרו על ידי ביצוע שלבים 7-19 מכילים את בדיקת הנוגדנים, רצף קשירה, רצף גנום וברקוד תא. קריאות ממופות ייחודיות מ-anti-H3K27ac ו-anti-H3K27me3 היו רבות יותר באופן משמעותי מאשר מ-IgG בקרה (ראו איור 7A). זה מצביע על כך שהכריכה הספציפית של anti-H3K27ac ו- anti-H3K27me3 מגדילה את מספר המוצרים הרצויים. הטכנולוגיה המתקדמת ביותר לניתוח אפיגנום של תא יחיד, Paired-Tag, רוכשת כ-2,000 קריאות ייחודיות של H3K27ac ו-1,500 קריאות ייחודיות של H3K27me3 לכל גרעין. התוצאות שלנו הראו מספר גבוה בהרבה של קריאות ייחודיות (ממוצע 699,398 אותות H3K27ac לתא ו-505,433 אותות H3K27me3 לתא). התוצאות תמכו גם במסקנה כי ניסויים חוזרים ונשנים המשתמשים באותו תא בודד לשימוש חוזר מפחיתים את אובדן האות ומגדילים את צפיפות האות.

אותות REpi-seq המוצגים באיור 7A הוערכו על-ידי השוואת נתוני REpi-seq עם נתוני ChIP-seq בכמות גדולה. באיור 7B, בממוצע, 91% ±-3.24% מאותות H3K27ac מ-REpi-seq חפפו לשיאי H3K27ac ב-ChIP-seq בתפזורת. ניתוח זה מודד את רמת ה"דיוק" בניתוח אפיגנום של תא בודד18. הדיוק של השיטות האפיגנומיות החד-תאיות הנוכחיות עבור סימן ההיסטון הפעיל H3K4me3 הוא 53% (Drop-ChIP; H3K4me3)18, 50% (scChIC-seq; H3K4me3)19, ו-60% (ACT-seq; H3K4me3)20. בנוסף, הדיוק של REpi-seq עבור סימן ההיסטון הלא פעיל H3K27me3 היה, בממוצע, 52.09% ± 3.71% (איור 7C), בעוד שהדיוק עבור H3K27me3 היה 47% ב- ChIC-seq19 של תא יחיד. לסיכום, REpi-seq מציג דיוק גבוה בזיהוי H3K27ac ו- H3K27me3.

ניתחנו גם את ה"רגישות"18 של REpi-seq, אשר מודדת כמה פסגות של ChIP-seq בתפזורת זוהו על-ידי קריאות משוכפלות של REpi-seq (איור 7D,E). הרגישות של REpi-seq הייתה 55.30% ב-H3K27ac ו-50.94% ב-H3K27me3. בשיטות אפיגנום חד-תאיות אחרות, הרגישות היא 5% ב-Drop-ChIP (H3K4me3)18, 5% ב-ACT-seq (H3K4me3)20, ו-9.5% ב-scChIC-seq (H3K27me3)19. תוצאות אלה מצביעות על כך ש- REpi-seq רגיש בזיהוי אותות אפיגנטיים.

Figure 7
איור 7: מספרי אותות, דיוק ורגישות ב- REpi-seq. אותם ניסויים חזרו על עצמם 3 פעמים עם אותו תא בודד לשימוש חוזר (תא K562). (A) אותות נרכשים מאותם שמונה תאים בודדים. כל נקודה מייצגת תא בודד הניתן לשימוש חוזר. אותות ייחודיים מבקרת IgG (שחור), anti-H3K27me3 (כחול) ו- anti-H3K27ac (אדום) באותם תאים בודדים נספרו. אותות Anti-H3K27me3 ו-anti-H3K27ac היו גבוהים משמעותית מ-IgG בקרה, מה שמצביע על כך שקשירה ספציפית של נוגדנים מייצרת אותות בצורה יעילה יותר מאשר IgG בקרה. בר: ממוצע, סרגל שגיאה: סטיית תקן. (ב, ג) דיוק של REpi-seq H3K27ac (B) ו- H3K27me3 (C) קריאות ייחודיות. הדיוק של קריאות ייחודיות הנגזר מ- REpi-seq התבסס על חפיפה עם פסגות ChIP-seq ידועות מניתוח תאים בתפזורת K562 (H3K27ac: SRR3144862; H3K27me3: SRR069083). האחוזים של קריאות REpi-seq H3K27ac ו- H3K27me3 שאושרו על ידי פסגות ChIP-seq חושבו בכל תא בודד. התוצאות מבוטאות כאחוז ממוצע של 8 תאים בודדים. (ד, ה) רגישות של REpi-seq בזיהוי פסגות ידועות H3K27ac (D) ו- H3K27me3 (E). נעשה שימוש בקריאות ייחודיות של REpi-seq. פסגות H3K27ac ו-H3K27me3 שזוהו על-ידי ChIP-seq של תאים בתפזורת K562 בפרויקט ECODE (H3K27ac: ENCFF038DDS; H3K27me3: ENCFF031FSF) הוכרו על ידי REpi-seq קריאות ייחודיות. התוצאות מבוטאות כאחוז הממוצע של פסגות ChIP-seq המוכרות על ידי REpi-seq קריאות ייחודיות. לוחות B-E שוחזרו מ Ohnuki et al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מאגרים המשמשים בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: נוגדנים ובקרת IgG המשמשים בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: דנ"א אוליגונוקלאוטיד המשמש בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

וידאו משלים S1: ליקוט אוטומטי של תא בודד והעברה לצלחת PCR של 96 בארות (שלב 8.2.4). אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

סרטון משלים S2: הסרת סופרנטנט מבאר המכילה תא בודד באמצעות רובוט לטיפול בנוזלים (שלב 8.2.8.1). אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S3: הוספת 4% TEMED/שמן מינרלי לבאר המכילה תא בודד באמצעות רובוט לטיפול בנוזלים (שלב 8.2.8.2). אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

קוד משלים 1: תוכנית אוטומטית של הרובוט המטפל בנוזלים משלבים 8.2.8.1-8.2.8.2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול שלב אחר שלב עבור ניתוח רב-אפיגנומי של תא בודד שדווח לאחרונה באמצעות תאים בודדים לשימוש חוזר7. בפסקאות הבאות נדון בנקודות קריטיות, תוך הדגשת מגבלות אפשריות בפרוטוקול.

אחת הנקודות הקריטיות לאורך הפרוטוקול (משלבים 7.2-13) היא הימנעות מזיהום DNase. לתא בודד יש רק שני עותקים של דנ"א גנומי. לכן, פגיעה בדנ"א הגנומי מפחיתה באופן קריטי את מספר האות. הימנעות מזיהום עם DNase חיונית כדי להגן על שלמות ה- DNA הגנומי.

חדירות הריאגנטים על פני קרום התא / דופן התא היא גם קריטית לאורך כל הפרוטוקול. REpi-seq תוכנן לנתח את האפיגנום של תאים עכבריים ואנושיים ברמת התא הבודד. התנאים האופטימליים לשיטה ניסיונית זו צפויים להשתנות בהתאם לחדירות סוגי התאים והקרום הגרעיני לכל מגיב. לכן, כאשר השיטה מיושמת על תאים שאינם תאי עכבר ובני אדם, כגון תאי צמחים, שמרים וחיידקים, התנאים בכל שלב זקוקים לאופטימיזציה.

אנו מאמינים כי נקודה קריטית ספציפית לשלב 9.5 (חישול הפריימר האקראי הראשון) היא מהירות הקירור המהירה לאחר דנטורציה של הדנ"א הגנומי. קירור איטי והדרגתי לאחר דנטורציה עלול להפחית את יעילות החישול של הפריימרים האקראיים הנקשרים לדנ"א הגנומי. יתר על כן, בשלב 11 (קשירת קרבה), נקודה קריטית היא הרכב החיץ. חוצצים המכילים פוליאתילן גליקול (PEG) נמצאים בשימוש נרחב לשיטות קשירה מהירות יותר ביישומי ביולוגיה מולקולרית. ריכוז נמוך של PEG (למשל, <7.5%) מקדם היווצרות מהירה של דנ"א דו-גדילי ללא משקעים בדנ"א. עם זאת, ראינו כי חיץ הקשירה המכיל PEG גורם להתכווצות של חרוז הג'ל החד-תאי המכיל את התא הבודד (תא בודד לשימוש חוזר), דבר המצביע על כך שגודל הרשת של פיגום הפוליאקרילאמיד התכווץ. מכיוון שהתכווצות זו עלולה לגרום לנגישות מופחתת של ליגאז T4 DNA, החלטנו לא להשתמש בפרוטוקול הקשירה המהיר יותר עבור REpi-seq.

ב- REpi-seq, ניתן להעריך את התוצאות על ידי תדירות הזיהוי מחדש של אותות באותם תאים בודדים. תדירות הזיהוי מחדש שימושית לניטור תגובות, כולל קשירת קרבה עם בדיקת הנוגדנים והפריימר האקראי הראשון. דיווחנו בעבר7 כי 62.03% מקריאות H3K27ac בניסוי אחד אושרו בשני ניסויים משוכפלים, דבר המצביע על כך שהיעילות של קשירת קרבה בניסויים בודדים גבוהה יותר מאחוז הגילוי מחדש הכולל בניסויים חוזרים.

כמו כן, דיווחנו בעברעל 7 זיהוי מוצלח של RNA פולימראז II (Pol II) הנקשר לדנ"א בתאים בודדים לשימוש חוזר. קשה ללכוד את קשירת Pol II בשיטות האפיגנום החד-תאיות הנוכחיות בגלל האופי הזמני והבלתי יציב של קשירה זו.

גישות CUT&Tag מבוססות טרנספוזאז הנוכחיות לניתוח אפיגנום של תא יחיד דורשות שימור של אינטראקציה נוקלאוזומים-DNA. נוגדן מסוים נקשר לשינוי היסטון; לאחר מכן, טרנספוזאז המחובר לנוגדן חותך את הדנ"א הגנומי ומחדיר ברקוד DNA באתר מחשוף הדנ"א. תגובה זו תלויה באינטראקציה בין נוקלאוזומים (היסטון)-דנ"א. לכן, חיוני כי אינטראקציות נוקלאוזום-DNA ואת המבנה של חלבונים התא כרומטין להישאר שלם. לפיכך, גישות CUT&Tag מוטות באופן בלתי נמנע לאזורים נגישים של מבנה הכרומטין בניתוח שינויים בהיסטון.

ההטיה הבלתי נמנעת לעבר אזורי הכרומטין הנגישים מעכבת את הגדלת מספר האותות האפיגנטיים בניתוח אפיגנום של תא יחיד. מבני הכרומטין נוצרים על ידי סוגים רבים של אינטראקציות מולקולריות, כולל אינטראקציות DNA-נוקלאוזומים ונוקלאוזום-נוקלאוזומים באמצעות חלבונים הקשורים לנוקלאוזום. לכן, בחרנו שלא לשמר אינטראקציות DNA-חלבון וחלבון-חלבון בתאים בודדים לשימוש חוזר, תוך שמירה על מיקומם של חלבונים תאיים. תכונה זו מושגת באמצעות שימוש באקרילאמיד מונומרי ובתערובת פרפורמלדהיד (שלב פרוטוקול 7), אשר משנה את קבוצת האמינו על חלבונים תאיים במקום להצליב חלבון לחלבון או חלבון לדנ"א.

מיקומם של היסטונים וחלבונים הקשורים לגנום נשמר על ידי החיבור לפולימר פוליאקרילאמיד. נוקלאוזומים מפורק סביב 71-74 מעלות צלזיוס21. לכן, בתא בודד לשימוש חוזר, היסטונים ככל הנראה מפורקים ורגועים/מנותקים זה מזה לאחר שלב החישול של הפריימר האקראיהראשון (94 מעלות צלזיוס). זה עשוי להרפות את מבנה ההטרוכרומטין ולשפר את הנגישות של נוגדנים ומולקולות אחרות לאזורי הטרוכרומטין. מסקנה זו נתמכת על ידי התוצאות המדווחות שלנו7 המראות כי הטיה הקשורה למבנה הכרומטין מופחתת בתאים בודדים לשימוש חוזר בהשוואה לגישות CUT&Tag9.

החיבור של היסטון H3 לפוליאקרילאמיד נשמר לאחר לפחות 3 סבבים של דנטורציה של חום כאשר מיקום ההיסטונים בתא הבודד לשימוש חוזר נשמר במהלך ניסויים חוזריםונשנים 7. תכונה זו מאפשרת חזרה על אותו ניסוי באמצעות אותו תא בודד. ניסויים חוזרים תורמים להגדלת מספר האותות מתא בודד בהשוואה לגישות CUT&Tag.

אימות הוא עיקרון בסיסי במדע. עם זאת, אימות תוצאות ניסוי של תא בודד אינו אפשרי בגישות CUT&Tag, מכיוון שניסויים חוזרים ונשנים עם אותם תאים אינם אפשריים. הדנ"א הגנומי נבקע על ידי טרנספוזאז ומקבל את ברקוד הדנ"א עבור סימן אפיגנטי אחד. הדנ"א הגנומי השסוע משתחרר ממיקומו המקורי. לכן, גישת CUT&Tag נמצאת בעמדת נחיתות לניתוח סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד. תכונה זו של שיטות CUT&Tag עומדת בבסיס הפשרה של ירידה בצפיפות האות עם מספר מוגבר של סימנים אפיגנטיים לכל תא בודד.

כדי להימנע מבעיה זו, העתקנו דנ"א גנומי במקום לחתוך את הגנום ואז תייגנו את הדנ"א הגנומי המועתק בבדיקת DNA נוגדנים. REpi-seq מאפשר ניתוח של אותם תאים בודדים ומגביר את צפיפות האות. הוא גם מספק אמצעי לאימות תוצאות ניסוי, ניתוח אפיגנומי מרובה, ופתרון בעיית הפשרה בגישות CUT&Tag. למרות שהשיטה מתגברת על מגבלות הניתוח האפיגנומי מבוסס טרנספוזאז, היא עדיין אינה מסוגלת לנתח מספר גדול של תאים ברמה של תא יחיד. יש צורך בפיתוח נוסף.

לסיכום, REpi-seq מעתיק DNA גנומי במקום לחתוך את הגנום ולאחר מכן מתייג את הדנ"א הגנומי המועתק עם בדיקת DNA נוגדן. REpi-seq עדיין בחיתוליו וצריך להגדיל את תפוקת התאים. עם זאת, ל- REpi-seq יש חוזקות, המתגברות על המגבלות בשיטות האפיגנום הנוכחיות של תא יחיד: 1) הגדלת צפיפות האות על ידי הפחתת נשירה של אותות באמצעות ניסויים חוזרים ונשנים באותם תאים בודדים; 2) הפחתת הטיה מבנית על ידי צמצום אזורים בלתי נגישים המבוססים על מבנה הכרומטין; 3) מתן אימות של תוצאות ניסויים על ידי ניסויים חוזרים באותו תא בודד, 4) זיהוי אות המבוסס על הסתברות לגילוי מחדש של אותו אות בכל תא ותא; 5) ניתוח סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד ללא תחרות בין סימנים אפיגנטיים. התקדמות זו מאפשרת ניתוח מנגנונים אפיגנטיים בתא בודד, שהוא יישום חשוב ואינו אפשרי בשיטות אפיגנומיות חד-תאיות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד"ר אוהנוקי וד"ר טוסאטו הם ממציאים שותפים של פטנט שכותרתו "שיטות להכנת תא בודד לשימוש חוזר ושיטות לניתוח אפיגנום, שעתוק וגנום של תא בודד" (EP3619307 ו- US20200102604). בקשת הפטנט הוגשה בחלקה על סמך תוצאות ראשוניות הקשורות לטכנולוגיה המתוארת בכתב היד הנוכחי. ההמצאה או ההמצאות המתוארות והנטענות בבקשת פטנט זו נעשו בזמן שהממציאים היו עובדים במשרה מלאה של ממשלת ארה"ב. לכן, על פי 45 Code of Federal Regulations Part 7, כל הזכויות, הבעלות והעניין בבקשת פטנט זו הוקצו או צריכים על פי חוק להיות מוקצים לממשלת ארה"ב. ממשלת ארה"ב מעבירה חלק מהתמלוגים שהיא מקבלת לעובדיה הממציאים תחת 15 U.S. Code § 3710c.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר דיוויד סאנצ'ז-מרטין וד"ר כריסטופר באק על ההערות בשלב ההמשגה של הפרויקט. אנו מודים גם ל-Genomics Core, המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות על העזרה בניסויים מקדימים, והמשאב הביואינפורמטי השיתופי, CCR, NCI, NIH על הייעוץ בניתוח חישובי. אנו מודים לגב' אנה וורד על עזרתה באופטימיזציה של DNA פולימראז המשמש בשיטה. עבודה זו השתמשה במשאבים החישוביים של אשכול NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). פרויקט זה נתמך על ידי תוכנית Intramural של המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, פרס החדשנות של מנהל NCI (#397172), וקרנות פדרליות מהמכון הלאומי לסרטן תחת חוזה מס 'HHSN261200800001E. אנו מודים לד"ר טום מיסטלי, קרול תיל, דאגלס ר. לואי ולכל חברי המעבדה לאונקולוגיה תאית על הערות פרודוקטיביות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo- DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12 (2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Tags

פסילה גיליון 180
תא בודד לשימוש חוזר לניתוחים אפיגנומיים איטרטיביים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov,… More

Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter