Analyse der Wechselwirkung fluoreszierend markierter Proteine mit künstlichen Phospholipid-Mikrovesikeln mittels quantitativer Durchflusszytometrie

Summary

Hier beschreiben wir eine Reihe von Methoden zur Charakterisierung der Interaktion von Proteinen mit Membranen von Zellen oder Mikrovesikeln.

Abstract

Im menschlichen Körper verlaufen die meisten der wichtigsten physiologischen Reaktionen, die an der Immunantwort und der Blutgerinnung beteiligt sind, auf den Membranen der Zellen. Ein wichtiger erster Schritt in jeder membranabhängigen Reaktion ist die Bindung von Protein an die Phospholipidmembran. Ein Ansatz zur Untersuchung der Proteinwechselwirkung mit Lipidmembranen wurde unter Verwendung fluoreszierend markierter Proteine und Durchflusszytometrie entwickelt. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Protein-Membran-Interaktionen mit lebenden Zellen und natürlichen oder künstlichen Phospholipid-Vesikeln. Der Vorteil dieser Methode ist die Einfachheit und Verfügbarkeit von Reagenzien und Geräten. Bei dieser Methode werden Proteine mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert. Es können jedoch sowohl selbst hergestellte als auch kommerziell erhältliche, fluoreszierend markierte Proteine verwendet werden. Nach der Konjugation mit einem fluoreszierenden Farbstoff werden die Proteine mit einer Quelle der Phospholipidmembran (Mikrovesikel oder Zellen) inkubiert und die Proben mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die erhaltenen Daten können zur Berechnung der kinetischen Konstanten und des Gleichgewichts K_{d verwendet} werden. Darüber hinaus ist es möglich, die ungefähre Anzahl der Proteinbindungsstellen auf der Phospholipidmembran mit speziellen Kalibrierperlen abzuschätzen.

Introduction

Biomembranen trennen den inneren Inhalt tierischer Zellen und des extrazellulären Raums. Beachten Sie, dass Membranen auch Mikrovesikel umgeben, die während des Lebenszyklus der Zelle gebildet wurden, und Organellen. Die Zellmembran besteht überwiegend aus Lipiden und Proteinen. Membranproteine übernehmen Signal-, Struktur-, Transport- und Klebefunktionen. Die Lipiddoppelschicht ist aber auch essentiell für die Wechselbeziehung der tierischen Zelle mit dem extrazellulären Raum. Diese Arbeit schlägt eine Methode vor, um die periphere Wechselwirkung externer Proteine mit der Lipidmembran zu untersuchen.

Das auffälligste Beispiel für Reaktionen, die auf der äußeren Membranschicht einer tierischen Zelle auftreten, ist die Blutgerinnungsreaktion. Ein wichtiges Merkmal der Blutgerinnung ist, dass alle Hauptreaktionen auf den Phospholipidmembranen von Zellen und Mikrovesikeln ablaufen, die aus diesen Zellen entstehen, und nicht im Plasma ^1,2,3. Membranabhängige Reaktionen umfassen den Prozess des Startens der Koagulation (auf den Zellmembranen des Subendothels, des entzündeten Endothels oder der aktivierten Immunzellen, unter Beteiligung eines Gewebefaktors), alle Reaktionen der Hauptkaskadenaktivierung der Faktoren IX, X, Prothrombin; Aktivierung von Faktor XI durch Thrombin (auf den Membranen von aktivierten Blutplättchen, Erythrozyten, Lipoproteinen und Mikrovesikeln); Reaktionen des Protein-C-Signalwegs; Inaktivierung von Gerinnungsenzymen (auf den Membranen von Endothelzellen unter Beteiligung von Thrombomodulin-Cofaktoren, Endothelprotein-C-Rezeptor, Heparansulfat); und Kontaktwegreaktionen (auf Membranen von Blutplättchen und einigen Mikrovesikeln unter Beteiligung unbekannter Cofaktoren). Daher ist es unmöglich, die Blutgerinnung zu untersuchen, ohne die Wechselwirkung verschiedener Plasmaproteine mit der Membran von Blutzellen zu untersuchen.

Dieser Beitrag beschreibt eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Charakterisierung der Interaktion von Proteinen mit Lipidmembranen von Zellen oder Mikrovesikeln. Dieser Ansatz wurde ursprünglich vorgeschlagen, um die Wechselwirkung von Blutplasma mit Blutplättchen und künstlichen Phospholipidvesikeln zu untersuchen. Darüber hinaus interagieren die meisten der untersuchten Proteine direkt mit negativ geladenen Membranphospholipiden, insbesondere mit Phosphatidylserin ^4,5. Hinzu kommen Proteine, deren Interaktion mit der Membran durch spezielle Rezeptoren vermittelt^{wird 6}.

Eine wichtige Fähigkeit der Durchflusszytometrie ist die Unterscheidung zwischen freien und gebundenen Liganden ohne zusätzliche Trennung. Diese Eigenschaft der Zytometrie ermöglicht die Untersuchung der Ligandengleichgewichtsbindung am Endpunkt und hilft bei der Durchführung kontinuierlicher kinetischer Messungen. Die Technik ist unausgereift und erfordert keine komplexe Probenvorbereitung. Die Durchflusszytometrie wird aktiv eingesetzt, um die Dynamik der Wechselwirkung zwischen fluoreszierenden Peptiden, Rezeptoren und G-Proteinen in intakten und waschmitteldurchlässigen Neutrophilen^quantitativ zu untersuchen 7. Dieser Ansatz eignet sich auch für die Erforschung von Protein-DNA-Interaktionen und der Kinetik der Endonukleaseaktivität^{in Echtzeit 8}. Im Laufe der Zeit wurde diese Methode verwendet, um hochaffine Protein-Protein-Interaktionen mit gereinigten Lipidvesikeln⁹ oder, allgemeiner, mit Membranproteinen, die in einem hocheffizienten Sf9-Zellexpressionssystem¹⁰ exprimiert werden, quantitativ zu untersuchen. Quantitative Methoden wurden auch zur Charakterisierung von Protein-Liposom-Interaktionen mittels Durchflusszytometrie für Transmembranproteine^{beschrieben 11}.

Diese Technik verwendet selbst hergestellte Kalibrierperlen, um die Verwendung von kommerziell erhältlichen Perlen^{zu vermeiden 7}. Die zuvor^verwendeten Kalibrierperlen 7 sollten mit Fluorescein arbeiten, was das Sortiment an zugänglichen fluoreszierenden Liganden auf den Proteinen erheblich einschränkte. Darüber hinaus bietet dieses Dokument eine neue Möglichkeit, kinetische Daten für eine angemessene Zeitauflösung zu erfassen und zu analysieren. Obwohl diese Methode für künstliche Phospholipidvesikel beschrieben wird, gibt es keine offensichtlichen Einschränkungen für ihre Anpassungsfähigkeit an Zellen, natürliche Vesikel oder künstliche Phospholipidvesikel mit einer anderen Lipidzusammensetzung. Das hierin beschriebene Verfahren ermöglicht die Abschätzung der Parameter Wechselwirkung (k_on, k_off) und Gleichgewicht (K_d) und erleichtert die quantitative Charakterisierung der Anzahl der Proteinbindungsstellen auf der Membran. Beachten Sie, dass diese Technik eine ungefähre Schätzung der Anzahl der Bindungsstellen liefert. Die Vorteile der Methode sind ihre relative Einfachheit, Zugänglichkeit und Anpassungsfähigkeit an native Zellen und natürliche und künstliche Mikrovesikel.

Protocol

1. Markierung fluoreszierender Proteine Materialaufbereitung Bereiten Sie 1 M Natriumbicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9,0 vor, lagern Sie ihn bei 4 °C und verwenden Sie ihn innerhalb einer Woche. Bereiten Sie 1,5 m Hydroxylaminhydrochloridpuffer, pH 8,5, unmittelbar vor Gebrauch vor. Bereiten Sie eine 10 mg / ml Lösung mit Fluoreszenzfarbstoff (siehe Materialtabelle) in Dimethylsulfoxid vor.HINWEIS: Diese Lösung kann einen Monat lang b…

Representative Results

Das hierin beschriebene Durchflusszytometrieverfahren wird verwendet, um die Bindung von Plasmagerinnungsproteinen an aktivierte Blutplättchen zu charakterisieren. Zusätzlich wurden Phospholipidvesikel PS:PC 20:80 als Modellsystem eingesetzt. Diese Arbeit konzentriert sich hauptsächlich auf künstliche Phospholipidvesikel als Beispiel. Die Parameter des Zytometers, insbesondere die Photomultiplierröhrenspannung (PMT) und die Kompensation müssen für jedes spezifische Gerät, den Untersuchungsgegenstand (Zellen, kün…

Discussion

Die vorgeschlagene Methode kann für eine grobe Charakterisierung der Wechselwirkung von Proteinen mit Phospholipidmembranen aus verschiedenen Quellen und Zusammensetzungen angepasst werden. Die hier beschriebene quantitative Durchflusszytometrie räumt der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) in mehreren Parametern zu. Insbesondere hat es eine geringere Empfindlichkeit und Zeitauflösung und erfordert eine fluoreszierende Markierung von Proteinen. Die fluoreszierende Markierung kann bei vielen Proteinen zu einer Verände…

Materials

A23187	Sigma Aldrich	C7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific	A37573	fluorescent dye
Apyrase from potatoes	Sigma Aldrich	A2230
BD FACSCantoII	BD Bioscience
bovine serum albumin	VWR Life Science AMRESCO	Am-O332-0.1
Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97%	Sigma Aldrich	C4901-100G
Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer	Agilent
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7528-1KG
DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)	Thermo Fisher Scientific	D384
DMSO	Sigma Aldrich	D8418
EDTA disodium salt	VWR Life Science AMRESCO	Am-O105B-0.1
FACSDiva	BD Bioscience		cytometry data acquisition software
FlowJo	Tree Star		cytometer software for data analysis
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
Human Factor X	Enzyme research	HFX 1010
Hydroxylamine hydrochloride	Panreac	141914.1209
L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids	840053P
L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840032P
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G
Mini-Extruder	Avanti Polar Lipids	610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951	OriginLab Corporation		Statistical software
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade	VWR Life Science AMRESCO	97062-732
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9541-500G
Prostaglandin E1	Cayman Chemical	13010
Sephadex G25	GE Healthcare	GE17-0033-01	gel filtration medium for protein purification
Sepharose CL-2B	Sigma Aldrich	CL2B300-500ML	gel filtration medium for platelet purification
Sodium bicarbonate	Corning	61-065-RO
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014-500G
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S3139-250G
Spin collumns with membrane 0.2 µm	Sartorius	VS0171
Trisodium citrate dihydrate	Sigma Aldrich	S1804-1KG