組織診断のためのマウス脳のリアルタイム、2色刺激ラマン散乱イメージング
Summary
刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、強力で非破壊的でラベルフリーのイメージング技術です。新しい用途の1つは刺激ラマン組織学であり、タンパク質および脂質ラマン遷移における2色SRSイメージングを使用して、擬似ヘマトキシリンおよびエオジン画像を生成する。ここでは、組織診断のためのリアルタイムの2色SRSイメージングのためのプロトコルを実証します。
Abstract
刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、組織診断のための強力な光学イメージング技術として浮上している。近年、2色SRSは、脳腫瘍の迅速かつ信頼性の高い診断を可能にするヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)と同等の画像を提供できることが示されている。このような能力により、刺激的な術中がん診断アプリケーションが可能になりました。組織の2色SRSイメージングは、ピコ秒またはフェムト秒レーザー光源のいずれかで行うことができます。フェムト秒レーザには、高速ハイパースペクトルイメージングやリアルタイムの2色SRSイメージングなど、柔軟なイメージングモードを可能にするという利点があります。チャープレーザーパルスによるスペクトル集束アプローチは、通常、高いスペクトル分解能を達成するためにフェムト秒レーザーで使用されます。
直交変調とロックイン検出により、2色SRS集録を実現できます。パルスチャーピング、変調、および特性評価の複雑さは、この方法の広範な採用のボトルネックです。この記事では、スペクトル集束SRSとエピモードでのマウス脳組織のリアルタイム2色イメージングの実装と最適化を実証するための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、SRSの高速および分光イメージング機能を活用する幅広いSRSイメージングアプリケーションに使用できます。
Introduction
従来の組織診断は、染色プロトコルに続いて光学顕微鏡下での検査に依存していました。病理学者によって使用される1つの一般的な染色方法はH&E染色である:ヘマトキシリンは細胞核を紫がかった青色に染色し、エオジンは細胞外マトリックスおよび細胞質をピンク色に染色する。この単純な染色は、多くの組織診断タスク、特に癌診断のための病理学におけるゴールドスタンダードのままです。しかし、H&E組織病理学、特に術中設定で使用される凍結切片化技術には、依然として限界があります。染色手順は、組織の埋め込み、切片化、固定、および染色1を含む面倒なプロセスである。一般的な所要時間は 20 分以上です。凍結切片化中にH&Eを実行することは、マージン評価のために細胞の特徴または成長パターンを3Dで評価する必要があるため、複数の切片が一度に処理される場合、より困難になることがあります。さらに、術中の組織学的技術は、熟練した技術者および臨床医を必要とする。多くの病院における理事会認定病理学者の数の制限は、多くの場合、術中診療の制約である。このような制限は、デジタル病理学および人工知能ベースの診断2における急速な発展の関心によって緩和され得る。しかし、H&E染色の結果は技術者の経験に応じて変動するため、コンピュータベースの診断にはさらなる課題があります2。
これらの課題は、ラベルフリーの光学イメージング技術で対処できる可能性があります。そのような技術の1つはSRS顕微鏡法である。SRSは、同期パルスレーザー(ポンプとストークス)を使用して、分子振動を高効率で励起します3。最近の報告では、タンパク質および脂質のSRSイメージングが、無傷の新鮮な組織を有するH&Eと同等の画像(刺激ラマン組織学またはSRHとしても知られる)を生成することができ、これは組織処理の必要性をバイパスし、診断に必要な時間を大幅に短縮し、術中に適応させることを実証している4。さらに、SRS画像化は、2D画像が不十分な場合に診断のための追加情報を提供する3D画像を提供する5。SRHは偏りがなく、コンピュータベースの診断に容易に利用可能なデジタル画像を生成します。これは、術中のがん診断および腫瘍マージン分析、特に脳腫瘍6,7,8における可能な解決策として急速に浮上している。より最近では、組織の化学変化のSRSイメージングは、臨床医が異なる癌タイプまたはステージ9を層別化するのにさらに役立つ有用な診断情報を提供することも示唆されている。
組織診断アプリケーションにおけるその途方もない可能性にもかかわらず、SRSイメージングは、超高速レーザー、レーザー走査顕微鏡、および洗練された検出エレクトロニクスを含むイメージングプラットフォームに関連する複雑さのために、光学に特化した学術研究室にほとんど限られています。このプロトコルは、リアルタイムの2色SRSイメージングとマウス脳組織からの疑似H&E画像の生成のための一般的なフェムト秒レーザー光源の使用を実証する詳細なワークフローを提供します。プロトコルでは、次の手順について説明します。
アライメントとチャープの最適化
ほとんどのSRSイメージング方式では、励起源としてピコ秒レーザまたはフェムト秒レーザを使用します。フェムト秒レーザでは、レーザの帯域幅はラマン線幅よりもはるかに大きくなります。この制限を克服するために、スペクトル集束アプローチを用いて、フェムト秒レーザをピコ秒タイムスケールにチャープして、狭いスペクトル分解能10を達成する。最適なスペクトル分解能は、時間的チャープ(グループ遅延分散または単に分散とも呼ばれる)がポンプとストークスレーザに対して適切に一致している場合にのみ達成されます。ここでは、高分散ガラス棒を使用してレーザービームの分散を最適化するために必要なアライメント手順と手順を示します。
周波数校正
スペクトル集束SRSの利点は、ポンプとストークスレーザの間の時間遅延を変更することによって、ラマン励起を迅速に調整できることです。このような同調は、レーザー波長の同調と比較して、高速イメージングと信頼性の高いスペクトル取得を可能にします。ただし、励起周波数と時間遅延の線形関係には外部較正が必要です。既知のラマンピークを有する有機溶媒は、スペクトル集束SRSのためのラマン周波数を較正するために使用される。
リアルタイム、2 色イメージング
組織診断アプリケーションでは、大きな組織標本の解析に必要な時間を短縮するために、イメージング速度を上げることが重要です。脂質とタンパク質の同時2色SRSイメージングにより、レーザーや時間遅延を調整する必要がなくなり、イメージング速度が2倍以上向上します。これは、ロックインアンプ11による新規な直交変調技術およびデュアルチャネル復調を使用することによって達成される。このホワイトペーパーでは、直交変調とデュアルチャンネル画像集録のプロトコルについて説明します。
エピモードSRSイメージング
現在までに示されたSRS撮像の大部分は、伝送モードで行われている。エピモードイメージングは、組織12から後方散乱光子を検出する。病理学的用途では、外科標本は非常に大きくなり得る。透過モードイメージングの場合、組織切片化がしばしば必要であり、これは望ましくないことに余分な時間を必要とする。対照的に、エピモードイメージングは、無傷の外科標本で作業することができます。後方散乱光の収集にも同じ対物レンズを使用するため、透過イメージングに必要な高数値開口コンデンサーを揃える必要もありません。エピモードは、骨など、組織切片化が困難な場合の唯一の選択肢でもあります。これまで、脳組織の場合、エピモードイメージングは2mm13>の組織厚さに対して優れたイメージング品質を提供することを実証しました。このプロトコルは、偏光ビームスプリッタ(PBS)を使用して、組織によって偏光解除された散乱光子を収集します。カスタマイズされた検出器アセンブリ12の複雑さを犠牲にして、環状検出器を用いてより多くの光子を収集することができる。PBSアプローチは実装が簡単で(蛍光に似ています)、標準フォトダイオードはすでに伝送モード検出に使用されています。
擬似H&E画像生成
2色のSRS画像が収集されたら、H&E染色をシミュレートするために色を変更することができます。この論文は、病理学アプリケーションのために脂質およびタンパク質SRS画像を疑似H&E SRS画像に変換する手順を実証する。実験プロトコルは、高品質のSRS画像を生成するために必要な重要なステップを詳述しています。ここに示される手順は、組織診断に適用可能であるだけでなく、薬物画像化および代謝画像化14,15などの他の多くのハイパースペクトルSRS画像化用途にも適合させることができる。
一般的なシステム要件
このプロトコルのレーザシステムは、2本の同期フェムト秒レーザビームを出力できなければなりません。システムは理想的には、レーザービームの1つの広い波長チューニングのための光学パラメトリック発振器(OPO)を備えています。このプロトコルのセットアップでは、2つのレーザー(1,040 nmの固定ビーム1つと、680 ~ 1,300 nmの範囲のOPOベースの調整可能なビーム)を80 MHzの繰り返しレートで出力する市販のレーザーシステムInsight DS+を使用します。SRSイメージングには、大手顕微鏡メーカーまたは自家製のレーザー走査顕微鏡を使用できます。利用される顕微鏡は、市販の直立顕微鏡フレームの上に構築された直立レーザー走査顕微鏡です。レーザービームをスキャンするために、5mmガルボミラーのペアが使用されます。自家製のレーザー走査顕微鏡を採用することを選択したユーザについては、レーザ走査顕微鏡16の構築のために以前に公開されたプロトコルを参照されたい。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルで提示される2色SRSイメージング方式は、1色SRSイメージングの適切な実装にかかっています。単色SRSイメージングでは、重要なステップは空間アライメント、時間アライメント、変調深度、位相シフトです。2つのビームを空間的に結合することは、ダイクロイックミラーによって達成される。ビームをダイクロイックミラーに送る際の微調整には、いくつかのステアリングミ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH R35 GM133435からD.F.までによって支持された。
Materials
| 100 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-100-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm |
| 20 MHz bandpass filter | Minicircuits | BBP-21.4+ | Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 – 23.6 MHz, 50 Ω |
| 200 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-200-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm |
| Achromatic Half Waveplate | Union Optic | WPA2210-650-1100-M25.4 | Broadband half waveplate |
| Achromatic Quarter Waveplate | Union Optic | WPA4210-650-1100-M25.4 | Broadband quarter waveplate |
| Beam Sampler | THORLABS | BSN11 | 10:90 Plate Beamsplitter |
| Dichroic Mirror | THORLABS | DMSP1000 | Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used. |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used. |
| Electrooptic Amplitude Modulator | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used. |
| False H&E Staining Script | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in |
| Fast Photodiode | THORLABS | DET10A2 | Si Detector, 1 ns Rise Time |
| Frequency Divider | PRL-220A | Pulse Research Lab | TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output. |
| Highly Dispersive Glass Rods | Union Optic | CYLROD01 | High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm |
| Insight DS+ | Newport | Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. | |
| Lock-in Amplifier | Liquid Instruments | Moku Lab | Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well. |
| Mirrors | THORLABS | BB05-E03-10 | Broadband Dielectric Mirror, 750 – 1,100 nm. Silver mirrors can also be used. |
| Motorized Delay Stage | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work. |
| Oil Immersion Condensor | Nikon | CSC1003 | 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used. |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS7054 | Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work. |
| Phase Shifter | SigaTek | SF50A2 | For shifting the phase of the modulation frequency |
| Photodiode | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used. |
| Polarizing Beam Splitter | Union Optic | PBS9025-620-1000 | Broadband polarizing beamsplitter |
| Refactive Index Database | refractiveindex.info | ||
| Retro-reflector | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used. |
| RF Power Amplifier | Minicircuits | ZHL-1-2W+ | Gain Block, 5 – 500 MHz, 50 Ω |
| Scan Mirrors | Cambridge Technologies | 6215H | We used a 5mm mirror set with silver coating |
| ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | Laser scanning microscope control software |
| Shortpass Filter | THORLABS | FESH1000 | 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary. |
| Upright Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope. |
| Water Immersion Objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used. |
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