Análise de alta produtividade da extinção não fotoquímica nas culturas usando fluorometria modulada de clorofila modulada de pulso

Summary

O protocolo introduz um método de alta produtividade para medir o relaxamento da extinção não fotoquímica por fluorometria modulada de clorofila modulada de pulso. O método é aplicado ao max glycine cultivado em campo e pode ser adaptado a outras espécies para testar a diversidade genética ou populações de reprodução.

Abstract

A fotossíntese não é otimizada em variedades modernas de culturas e, portanto, oferece uma oportunidade de melhoria. Acelerar o relaxamento da extinção não fotoquímica (NPQ) provou ser uma estratégia eficaz para aumentar o desempenho fotossintético. No entanto, o potencial de procriar para melhorar o NPQ e uma compreensão completa da base genética do relaxamento do NPQ é carente devido a limitações de supersemplagem e coleta de dados de plantas cultivadas em campo. Com base em relatórios anteriores, apresentamos um ensaio de alto rendimento para análise das taxas de relaxamento do NPQ na Glycine max (soja) utilizando fluorometria de clorofila modulada por pulso (PAM). Os discos de folha são amostrados de soja cultivada em campo antes do transporte para um laboratório onde o relaxamento do NPQ é medido em um pam-fluorômetro fechado. Os parâmetros de relaxamento do NPQ são calculados encaixando uma função bi-exponencial aos valores NPQ medidos após uma transição de alta para baixa luz. Usando este método, é possível testar centenas de genótipos dentro de um dia. O procedimento tem o potencial de triagem de painéis mutantes e de diversidade para variação no relaxamento do NPQ e, portanto, pode ser aplicado tanto a questões fundamentais quanto aplicadas de pesquisa.

Introduction

A fotossíntese consiste em absorção de luz, transferência primária de elétrons, estabilização de energia e síntese e transporte de produtos fotossintéticos¹. Entender cada passo é vital para orientar os esforços para aumentar a eficiência fotossintética da cultura. A luz afeta a taxa de fotossíntese, exigindo o equilíbrio da oferta de energia, na forma de fótons, com demanda por redução de equivalentes. Quando a oferta excede a demanda, por exemplo sob alta luz ou durante a redução da fixação de CO₂ causada pelo fechamento estomatal, o acúmulo de energia reduzida aumenta a probabilidade de formação de espécies de oxigênio reativo com o potencial de danificar o aparelho fotossintético e prejudicar o transporte de elétrons. Portanto, para evitar danos, as plantas desenvolveram vários mecanismos de fotoproteção, incluindo a desintoxicação de espécies reativas de oxigênio e a extinção não fotoquímica dos estados de clorofila animados (NPQ)².

Manter altas taxas de fotossíntese é um desafio em um ambiente de campo. Mudanças sazonais e diurnas, juntamente com flutuações ambientais como movimentos de folhas induzidas pelo vento e cobertura transitória de nuvens, causam mudanças na quantidade e intensidade de luz recebidas pelas plantas para a fotossíntese³. O NPQ dissipa o excesso de energia luminosa e pode ajudar a evitar danos fotográficos, permitindo taxas sustentadas de fotossíntese em alta luz⁴. No entanto, o NPQ prolongado durante transições de alta a baixa luz continua a dissipar a energia que poderia ser usada para a redução de carbono⁵. Como resultado, acelerar o relaxamento do NPQ pode aumentar a eficiência da fotossíntese⁶, tornando o relaxamento do NPQ um alvo atraente para a melhoria da cultura.

A análise de fluorescência modulada de clorofila modulada de pulso (PAM) pode ser utilizada para calcular NPQ a partir de parâmetros mensuráveis (Tabela Suplementar 1 e Tabela Suplementar 2)^7,8,9. Este artigo tem como foco determinar as taxas de relaxamento do NPQ em plantas cultivadas em campo com o objetivo de triagem da variação natural do germoplasma. No entanto, a análise da fluorometria de clorofila PAM também pode ser usada para uma ampla variedade de propósitos, aplicada a espécies que vão de algas a plantas mais altas, e é revisada em outros lugares ^7,8,9.

Em uma folha ou célula adaptada ao escuro, os centros de reação photosystem II (PSII) estão abertos para receber elétrons e não há NPQ. Ligar uma luz de baixa intensidade provoca fluorescência de clorofila, evitando o transporte de elétrons através do PSII. A fluorescência mínima registrada neste estado adaptado ao escuro é descrita pelo parâmetro F_o. A aplicação de um pulso de luz de alta intensidade a uma folha adaptada à escuridão pode reduzir rapidamente a primeira piscina estável de aceitadores de elétrons de quinones ligada ao local da quinona A. Isso bloqueia temporariamente a capacidade de transferência de elétrons em centros de reação PSII, que são então ditos estar fechados e incapazes de receber elétrons da divisão da água. Usando uma curta duração de pulso, não há tempo suficiente para estimular o NPQ. A fluorescência de clorofila resultante equivale ao valor máximo obtido na ausência de NPQ, ou fluorescência máxima, F_m. A diferença entre fluorescência mínima e máxima é referida como fluorescência variável, F_v. O rendimento quântico fotoquímico máximo do fotossistema II (F_v/F_m) é calculado a partir desses dois parâmetros usando a seguinte equação:

F_v/F_m = (F_{m-F o})/F_m

Isso pode fornecer um indicador importante da função fotossistema e estresse. Ligar uma luz actínica (fotossintética) estimula a saciedação não fotoquímica, e a aplicação subsequente de um flash saturado permite a medição da fluorescência máxima adaptada pela luz, F_m‘. Comparando a diferença entre fluorescência máxima adaptada à luz e escura, o NPQ pode ser calculado de acordo com a equação Stern-Volmer¹⁰:

NPQ = F_m/F_m‘ – 1

Em plantas mais altas, o NPQ tem sido descrito como consistindo de pelo menos cinco componentes distintos, incluindo qE, qT, qZ, qI e qH. Os mecanismos precisos envolvidos no NPQ não são totalmente compreendidos; no entanto, o qE é considerado o principal componente do NPQ na maioria das plantas. Fatores cruciais para o engajamento total do qE foram encontrados para incluir o acúmulo de um gradiente de prótons através da membrana de timokoide, a atividade do subunidade fotosystem II S^11,12, e xanthophylls desepoxidados, antheraxantina, luteína, e em particular zeaxantina¹³. qE relaxa o mais rápido de qualquer componente NPQ (< 2 min)¹⁴, e a ativação reversível do qE é, portanto, particularmente importante para a adaptação às intensidades de luz em mudança. Uma segunda fase mais lenta de relaxamento NPQ (~2-30 min) abrange tanto qT, relacionado às transições estaduais, quanto qZ, envolvendo interconversão de zeaxantina à violaxantina¹⁵. O relaxamento lento (> 30 min) do NPQ pode incluir tanto a saciação fotoinhibitória (qI)¹⁶ quanto processos independentes da fotodamagem^17,18, como o qH, que é mantido saciando nas antenas periféricas do PSII mediado por uma proteína lipocalina plastida^19,20.

O NPQ aumenta durante a exposição à alta luz. A transferência subsequente para a luz baixa pode resultar em queda na regulação do NPQ. A decadência de fases de relaxamento rápido, intermediário e lento pode ser capturada nos parâmetros de uma função bi-exponencial 15,21,22,23

NPQ = Aq1 ^(-t/τ1) + Aq2^(-t/τ2) + Aq3

A base teórica para a função bi-exponencial baseia-se no pressuposto da utilização de primeira ordem de quenchers hipotéticos, incluindo qE (Aq1), o relaxamento combinado de qZ e qT (Aq2), com as correspondentes constantes de tempo τq1 e τq2, e NPQ de longo prazo, que inclui processos independentes qI e fotodamage (Aq3). Como tal, a função bi-exponencial fornece uma representação mais realista dos múltiplos processos biológicos conectados envolvidos na saciação da fluorescência da clorofila em comparação com uma equação de Hill mais simples que carece de uma base teórica²⁴.

O NPQ pode ser medido usando uma variedade de fluorômetros PAM disponíveis comercialmente^25,26, desde dispositivos simples portáteis²⁷ até sistemas fechados mais avançados²⁸. No entanto, uma limitação de várias dessas abordagens é um rendimento relativamente baixo, o que torna a triagem de grandes coleções de plantas desafiadoras sem múltiplos dispositivos e uma equipe de pesquisadores. Para abordar essa questão, McAusland et al. desenvolveram um procedimento baseado no tecido da folha excisada e o utilizaram para identificar diferenças na fluorescência de clorofila entre duas cultivares^{de trigo 29}. A atração dessa abordagem é que os discos de folha de imagem, retirados de várias plantas com um único dispositivo, podem facilitar a triagem de centenas de genótipos dentro de um dia. Isso permite avaliar a variação do relaxamento do NPQ como parte de estudos de associação de genomas, ou para triagem de populações de reprodução com potencial para aumentar a eficiência fotossintética da cultura e, em última instância, produzir.

Com base nos achados de McAusland et ^al.29, utilizamos a análise de fluorescência de clorofila PAM de discos de folha para triagem de alto rendimento das taxas de relaxamento do NPQ no Glycine max (G.max; soja). Este protocolo usa o CF Imager²⁵, que é comparável a outros sistemas fechados de PAM disponíveis comercialmente, como o popular FluorCam²⁶. Com uma sala escura para adaptação de amostras, os usuários podem imaginar pratos de 96 poços, pratos de Petri e pequenas plantas. A principal vantagem dessa abordagem é o aumento da produtividade proporcionada pelo uso de discos de folha em comparação com a análise sequencial de plantas individuais. Aqui apresentamos resultados representativos e um método de amostragem, medição e análise de NPQ em plantas cultivadas em campo.

Protocol

1. Plantio de sementes Escolha um campo com solo fértil, bem drenado, mas não arenoso, e com um pH de quase 6,5. Marque 1,2 m de linha com 0,75 m de espaçamento marcando o chão com uma enxada. Plante 50 sementes/m de G.max cv. IA3023 a 3 cm de profundidade ao longo de cada parcela no início da estação de cultivo, quando as temperaturas do solo estão entre 25 e 30 °C.NOTA: Para fins de triagem da diversidade genética, espera-se que vários genótipos diferentes s…

Representative Results

A Figura 1A retrata uma medição típica do NPQ na soja cultivada em campo. As plantas foram cultivadas em Urbana, IL (latitude 40,084604°, longitude -88,227952°) durante o verão de 2021, com sementes plantadas em 5 de junho. 2021. Os discos de folha foram amostrados após 30 dias de plantio de sementes, e as medições foram feitas com o protocolo fornecido (Tabela 1). Os valores de F v/Fm e NPQ foram calculados para cada disco de folha (Tabela…

Discussion

A escolha cuidadosa e o manuseio de discos de folha são fundamentais para obter medições confiáveis do NPQ. Primeiro, danos ao tecido, como manuseio áspero com pinças, introduzirão estresse, resultando em valores baixos para a máxima eficiência quântica da fotossíntese. As plantas não estressadas normalmente têm valores F_v/F_m de cerca de 0,83¹⁸, com declínios significativos indicando uma redução no desempenho fotossintético^…

Materials

24 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012929	Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012931	Country of Origin: United States of America
Aluminum foil	Antylia Scientific	61018-56	Country of Origin: United States of America
Black marker pen	Sharpie	SAN30001	Country of Origin: United States of America
CF imager	Technologica Ltd.	N/A	chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm	Humboldt Mfg Co	H9665	Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software	Technologica Ltd.	N/A	imaging software Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters	Amazon	B07P6XCTGV	Country of Origin: United States of America
Marker stakes	John Henry Company	KN0151	Country of Origin: United States of America
Paper scissors	VWR	82027-596	Country of Origin: United States of America
Parafilm	Bemis Company Inc.	S3-594-6	Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers	Fisher Scientific	14-130M	Country of Origin: United States of America