High-Throughput analyse van niet-fotochemische blussing in gewassen met behulp van pulsamplitude gemoduleerde chlorofylfluorometrie
Summary
Het protocol introduceert een high-throughput methode voor het meten van de ontspanning van niet-fotochemische quenching door pulsamplitude gemoduleerde chlorofyl fluorometrie. De methode wordt toegepast op in het veld gekweekte Glycine max en kan worden aangepast aan andere soorten om te screenen op genetische diversiteit of broedpopulaties.
Abstract
Fotosynthese is niet geoptimaliseerd in moderne gewasvariëteiten en biedt daarom een mogelijkheid voor verbetering. Het versnellen van de ontspanning van niet-fotochemisch blussen (NPQ) is een effectieve strategie gebleken om de fotosynthetische prestaties te verhogen. Het potentieel om te fokken voor verbeterde NPQ en een volledig begrip van de genetische basis van NPQ-ontspanning ontbreekt echter vanwege beperkingen van oversampling en gegevensverzameling van in het veld gekweekte gewasplanten. Voortbouwend op eerdere rapporten presenteren we een high-throughput assay voor analyse van NPQ-relaxatiesnelheden in Glycine max (sojaboon) met behulp van pulsamplitude gemoduleerde (PAM) chlorofylfluorometrie. Bladschijven worden bemonsterd van in het veld gekweekte sojabonen voordat ze naar een laboratorium worden vervoerd waar NPQ-relaxatie wordt gemeten in een gesloten PAM-fluorometer. NPQ-relaxatieparameters worden berekend door een bi-exponentiële functie toe te passen op de gemeten NPQ-waarden na een overgang van hoog naar weinig licht. Met behulp van deze methode is het mogelijk om binnen een dag honderden genotypen te testen. De procedure heeft het potentieel om mutanten- en diversiteitspanels te screenen op variatie in NPQ-relaxatie en kan daarom worden toegepast op zowel fundamentele als toegepaste onderzoeksvragen.
Introduction
Fotosynthese bestaat uit lichtabsorptie, primaire elektronenoverdracht, energiestabilisatie en de synthese en het transport van fotosynthetische producten1. Het begrijpen van elke stap is van vitaal belang om de inspanningen te begeleiden om de fotosynthetische efficiëntie van het gewas te verhogen. Licht beïnvloedt de snelheid van fotosynthese, waardoor de energievoorziening in evenwicht moet worden gebracht, in de vorm van fotonen, met de vraag naar reducerende equivalenten. Wanneer het aanbod groter is dan de vraag, bijvoorbeeld bij veel licht of tijdens verminderde CO 2-fixatie veroorzaakt door stomatale sluiting, verhoogt de opbouw van reducerend vermogen de kans op de vorming van reactieve zuurstofsoorten met het potentieel om het fotosynthetische apparaat te beschadigen en het elektronentransport te belemmeren. Daarom hebben planten, om schade te voorkomen, verschillende fotobeschermende mechanismen ontwikkeld, waaronder ontgifting van reactieve zuurstofsoorten en niet-fotochemische doven van de geëxciteerde chlorofyltoestanden (NPQ)2.
Het handhaven van hoge snelheden van fotosynthese is een uitdaging onder een veldomgeving. Seizoensgebonden en dagelijkse veranderingen, samen met omgevingsfluctuaties zoals door de wind geïnduceerde bladbewegingen en voorbijgaande bewolking, veroorzaken verschuivingen in de hoeveelheid en intensiteit van het licht dat planten ontvangen voor fotosynthese3. NPQ dissipeert overtollige lichtenergie en kan helpen fotoschade te voorkomen terwijl het zorgt voor aanhoudende fotosynthese bij veel licht4. Langdurige NPQ tijdens overgangen bij hoog naar weinig licht blijft echter energie afvoeren die kan worden gebruikt voor koolstofreductie5. Als gevolg hiervan kan het versnellen van de ontspanning van NPQ de efficiëntie van fotosyntheseverhogen 6, waardoor NPQ-ontspanning een aantrekkelijk doelwit wordt voor gewasverbetering.
Pulsamplitudegemoduleerde chlorofylfluorescentie (PAM)-analyse kan worden gebruikt om NPQ te berekenen op basis van meetbare parameters (aanvullende tabel 1 pt aanvullende tabel 2)7,8,9. Dit artikel richt zich op het bepalen van NPQ-relaxatiepercentages in in het veld gekweekte planten met als doel de natuurlijke variatie in kiemplasma te screenen. PAM chlorofyl fluorometrie analyse kan echter ook worden gebruikt voor een breed scala aan doeleinden, toegepast op soorten variërend van algen tot hogere planten, en wordt elders beoordeeld 7,8,9.
In een donker aangepast blad of cel zijn de reactiecentra van fotosysteem II (PSII) open om elektronen te ontvangen en is er geen NPQ. Het inschakelen van een laag intensiteit meetlicht lokt chlorofylfluorescentie uit terwijl elektronentransport door PSII wordt vermeden. De geregistreerde minimale fluorescentie in deze aan het donker aangepaste toestand wordt beschreven door de parameter Fo. Het toepassen van een lichtpuls met hoge intensiteit op een donker aangepast blad kan snel de eerste stabiele elektronenacceptorpool van chinonen verminderen die gebonden zijn aan de chinon A-site. Dit blokkeert tijdelijk de elektronenoverdrachtscapaciteit in PSII-reactiecentra, waarvan dan wordt gezegd dat ze gesloten zijn en niet in staat zijn om elektronen te ontvangen van watersplitsing. Door gebruik te maken van een korte pulsduur is er onvoldoende tijd om NPQ te stimuleren. De resulterende chlorofylfluorescentie is gelijk aan de maximale waarde die kan worden verkregen in afwezigheid van NPQ, of maximale fluorescentie, Fm. Het verschil tussen minimale en maximale fluorescentie wordt variabele fluorescentie genoemd, Fv. De maximale fotochemische kwantumopbrengst van fotosysteem II (Fv/Fm) wordt berekend op basis van deze twee parameters met behulp van de volgende vergelijking:
Vv/Fm = (Fm-F o)/Fm
Dit kan een belangrijke indicator zijn voor de functie en stress van het fotosysteem. Het inschakelen van een actinisch (fotosynthetisch) licht stimuleert niet-fotochemisch blussen, en de daaropvolgende toepassing van een verzadigingsflits maakt het mogelijk om de aan licht aangepaste maximale fluorescentie te meten, Fm‘. Door het verschil tussen donkere en licht-aangepaste maximale fluorescentie te vergelijken, kan NPQ worden berekend volgens de Stern-Volmer vergelijking10:
NPQ = Vm/Vm‘ – 1
In hogere fabrieken is NPQ beschreven als bestaande uit ten minste vijf verschillende componenten, waaronder qE, qT, qZ, qI en qH. De precieze mechanismen die betrokken zijn bij NPQ zijn niet volledig begrepen; qE wordt echter beschouwd als het belangrijkste onderdeel van NPQ in de meeste planten. Cruciale factoren voor volledige betrokkenheid van qE zijn onder meer de opbouw van een protongradiënt over het thylakoïde membraan, de activiteit van fotosysteem II-subeenheid S11,12 en gede-epoxidateerde xanthofylen, antheraxanthine, luteïne en in het bijzonder zeaxanthine13. qE ontspant het snelst van alle NPQ-componenten (< 2 min)14, en omkeerbare activering van qE is daarom bijzonder belangrijk voor aanpassing aan verschuivende lichtintensiteiten. Een tweede langzamere fase van NPQ-ontspanning (~ 2-30 min) omvat zowel qT, gerelateerd aan toestandsovergangen, als qZ, waarbij interconversie van zeaxanthine naar violaxanthine15 betrokken is. Langzaam ontspannen (> 30 min) van NPQ kan zowel foto-inflammatoire quenching (qI)16 als processen onafhankelijk van fotoschade 17,18 omvatten, zoals qH, dat langdurig blussen in de perifere antennes van PSII gemedieerd door een plastide lipocaïn eiwit19,20.
NPQ neemt toe tijdens blootstelling aan veel licht. Daaropvolgende overdracht naar weinig licht kan resulteren in downregulatie van NPQ. Het verval van snelle, intermediaire en langzame ontspannende fasen kan worden vastgelegd in de parameters van een bi-exponentiële functie 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
De theoretische basis voor de bi-exponentiële functie is gebaseerd op de aanname van eerste-orde gebruik van hypothetische quenchers, waaronder qE (Aq1), de gecombineerde ontspanning van qZ en qT (Aq2), met de overeenkomstige tijdconstanten τq1 en τq2, en lange termijn NPQ, waaronder qI en fotoschade onafhankelijke processen (Aq3). Als zodanig biedt de bi-exponentiële functie een meer realistische weergave van de meerdere verbonden biologische processen die betrokken zijn bij het blussen van chlorofylfluorescentie in vergelijking met een eenvoudigere Hill-vergelijking die een theoretische basis mist24.
NPQ kan worden gemeten met behulp van een verscheidenheid aan in de handel verkrijgbare PAM-fluorometers25,26, van eenvoudige draagbare apparaten27 tot meer geavanceerde gesloten systemen28. Een beperking van verschillende van deze benaderingen is echter een relatief lage doorvoer, waardoor het screenen van grote collecties planten een uitdaging is zonder meerdere apparaten en een team van onderzoekers. Om dit probleem aan te pakken, ontwikkelden McAusland et al. een procedure op basis van weggesneden bladweefsel en gebruikten deze om verschillen in chlorofylfluorescentie tussen twee tarwecultivarste identificeren 29. De aantrekkingskracht van deze aanpak is dat het afbeelden van bladschijven, genomen van meerdere planten met één apparaat, het screenen van honderden genotypen binnen een dag kan vergemakkelijken. Dit maakt het mogelijk om variatie in NPQ-relaxatie te beoordelen als onderdeel van genoombrede associatiestudies, of voor het screenen van fokpopulaties met het potentieel om de fotosynthetische efficiëntie van gewassen en uiteindelijk de opbrengst te verhogen.
Voortbouwend op de bevindingen van McAusland et al.29, gebruiken we PAM chlorofyl fluorescentie analyse van bladschijven voor high-throughput screening van NPQ relaxatiesnelheden in Glycine max (G.max; sojabonen). Dit protocol maakt gebruik van de CF Imager25, die vergelijkbaar is met andere in de handel verkrijgbare closed-PAM-systemen, zoals de populaire FluorCam26. Met een donkere ruimte voor aanpassing van monsters kunnen gebruikers 96-well platen, petrischalen en kleine planten in beeld brengen. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is de toename van de doorvoer die wordt geboden door het gebruik van bladschijven in vergelijking met sequentiële analyse van individuele planten. Hierin presenteren we representatieve resultaten en een methode voor het bemonsteren, meten en analyseren van NPQ in in het veld gekweekte planten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zorgvuldige keuze en behandeling van bladschijven zijn van cruciaal belang om betrouwbare metingen van NPQ te verkrijgen. Ten eerste zal schade aan het weefsel, zoals ruwe behandeling met een pincet, stress veroorzaken, wat resulteert in lage waarden voor de maximale kwantumefficiëntie van fotosynthese. Niet-gestreste planten hebben doorgaans Fv/Fm-waarden van ongeveer 0,8318, met significante dalingen die wijzen op een afname van de fotosynthetische presta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door het onderzoeksproject Realizing Increased Photosynthetic Efficiency (RIPE) dat wordt gefinancierd door de Bill &Melinda Gates Foundation, Foundation for Food and Agriculture Research en het U.K. Foreign, Commonwealth &Development Office onder subsidienummer OPP1172157.
Materials
| 24 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012929 | Country of Origin: United States of America |
| 96 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012931 | Country of Origin: United States of America |
| Aluminum foil | Antylia Scientific | 61018-56 | Country of Origin: United States of America |
| Black marker pen | Sharpie | SAN30001 | Country of Origin: United States of America |
| CF imager | Technologica Ltd. | N/A | chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom |
| Cork-borer, 7mm | Humboldt Mfg Co | H9665 | Country of Origin: United States of America |
| FluorImager V2.305 Software | Technologica Ltd. | N/A | imaging software Country of Origin: United Kingdom |
| iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters | Amazon | B07P6XCTGV | Country of Origin: United States of America |
| Marker stakes | John Henry Company | KN0151 | Country of Origin: United States of America |
| Paper scissors | VWR | 82027-596 | Country of Origin: United States of America |
| Parafilm | Bemis Company Inc. | S3-594-6 | Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America |
| Solid rubber stoppers | Fisher Scientific | 14-130M | Country of Origin: United States of America |
Referências
- Blankenship, R. E. . Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).
- Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
- Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
- Slattery, R. A., Ort, D. R. Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement. Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).
- Zhu, X. -. G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
- Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).
- Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
- Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
- Li, X. -. P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
- Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -. M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
- Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
- Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
- Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
- Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
- Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
- Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
- Dall’Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).
- Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
- Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
- Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
- Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
- Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
- Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).
- Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
- McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).
- Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).
- Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
- Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -. A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
- Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
- Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).
