Analyse à haut débit de la trempe non photochimique dans les cultures à l’aide de la fluorométrie de chlorophylle modulée en amplitude d’impulsion

Summary

Le protocole introduit une méthode à haut débit pour mesurer la relaxation de la trempe non photochimique par fluorométrie de chlorophylle modulée en amplitude d’impulsion. La méthode est appliquée à Glycine max cultivée en plein champ et peut être adaptée à d’autres espèces pour dépister la diversité génétique ou les populations reproductrices.

Abstract

La photosynthèse n’est pas optimisée dans les variétés de cultures modernes et offre donc une opportunité d’amélioration. Accélérer la relaxation de la trempe non photochimique (NPQ) s’est avéré être une stratégie efficace pour augmenter les performances photosynthétiques. Cependant, le potentiel de sélection pour améliorer le NPQ et une compréhension complète de la base génétique de la relaxation du NPQ font défaut en raison des limites du suréchantillonnage et de la collecte de données à partir de plantes cultivées en plein champ. En nous appuyant sur des rapports précédents, nous présentons un test à haut débit pour l’analyse des taux de relaxation NPQ dans Glycine max (soja) en utilisant la fluorométrie de chlorophylle modulée en amplitude d’impulsion (PAM). Les disques de feuilles sont échantillonnés à partir de soja cultivé en plein champ avant d’être transportés vers un laboratoire où la relaxation du NPQ est mesurée dans un fluoromètre PAM fermé. Les paramètres de relaxation NPQ sont calculés en adaptant une fonction bi-exponentielle aux valeurs NPQ mesurées après une transition de la lumière haute à la lumière faible. En utilisant cette méthode, il est possible de tester des centaines de génotypes en une journée. La procédure a le potentiel de filtrer les panels mutants et de diversité pour la variation de la relaxation NPQ, et peut donc être appliquée à des questions de recherche fondamentale et appliquée.

Introduction

La photosynthèse consiste en l’absorption de la lumière, le transfert d’électrons primaires, la stabilisation de l’énergie, ainsi que la synthèse et le transport de produits photosynthétiques¹. Comprendre chaque étape est essentiel pour guider les efforts visant à augmenter l’efficacité photosynthétique des cultures. La lumière affecte le taux de photosynthèse, nécessitant un apport énergétique d’équilibrage, sous forme de photons, avec une demande d’équivalents réducteurs. Lorsque l’offre dépasse la demande, par exemple sous haute lumière ou lors d’une fixation réduite du CO₂ causée par la fermeture stomatique, l’accumulation de puissance réductrice augmente la probabilité de formation d’espèces réactives de l’oxygène susceptibles d’endommager l’appareil photosynthétique et d’entraver le transport des électrons. Par conséquent, pour prévenir les dommages, les plantes ont développé plusieurs mécanismes photoprotecteurs, y compris la désintoxication des espèces réactives de l’oxygène et la trempe non photochimique des états chlorophylliens excités (NPQ)².

Maintenir des taux élevés de photosynthèse est difficile dans un environnement de terrain. Les changements saisonniers et diurnes, ainsi que les fluctuations environnementales telles que les mouvements des feuilles induits par le vent et la couverture nuageuse transitoire, provoquent des changements dans la quantité et l’intensité de la lumière reçue par les plantes pour la photosynthèse³. Le NPQ dissipe l’excès d’énergie lumineuse et peut aider à prévenir les photo-dommages tout en permettant des taux soutenus de photosynthèse à haute luminosité⁴. Cependant, le NPQ prolongé pendant les transitions de lumière élevée à faible luminosité continue de dissiper l’énergie qui pourrait être utilisée pour la réduction du carbone⁵. En conséquence, accélérer la relaxation du NPQ peut augmenter l’efficacité de la photosynthèse⁶, faisant de la relaxation du NPQ une cible attrayante pour l’amélioration des cultures.

L’analyse de fluorescence de la chlorophylle (PAM) modulée en amplitude d’impulsion (PAM) peut être utilisée pour calculer le NPQ à partir de paramètres mesurables (tableau supplémentaire 1 et tableau supplémentaire 2)^7,8,9. Cet article se concentre sur la détermination des taux de relaxation du NPQ chez les plantes cultivées en plein champ dans le but de dépister la variation naturelle du matériel génétique. Cependant, l’analyse de la fluorométrie de la chlorophylle PAM peut également être utilisée à des fins très diverses, appliquée à des espèces allant des algues aux plantes supérieures, et est examinée ailleurs ^7,8,9.

Dans une feuille ou une cellule adaptée à l’obscurité, les centres de réaction du photosystème II (PSII) sont ouverts pour recevoir des électrons et il n’y a pas de NPQ. L’allumage d’une lumière de mesure de faible intensité provoque une fluorescence de la chlorophylle tout en évitant le transport d’électrons à travers PSII. La fluorescence minimale enregistrée dans cet état adapté à l’obscurité est décrite par le paramètre F_o. L’application d’une impulsion lumineuse de haute intensité à une feuille adaptée à l’obscurité peut rapidement réduire le premier pool d’accepteurs d’électrons stables de quinones liés au site de la quinone A. Cela bloque temporairement la capacité de transfert d’électrons dans les centres de réaction PSII, qui sont alors dits fermés et incapables de recevoir des électrons de la division de l’eau. En utilisant une courte durée d’impulsion, il n’y a pas assez de temps pour stimuler le NPQ. La fluorescence chlorophyllienne résultante est équivalente à la valeur maximale pouvant être obtenue en l’absence de NPQ, ou fluorescence maximale, F_m. La différence entre la fluorescence minimale et la fluorescence maximale est appelée fluorescence variable, F_v. Le rendement quantique photochimique maximal du photosystème II (F_v/F_m) est calculé à partir de ces deux paramètres à l’aide de l’équation suivante :

F_v/F_m = (F_{m-F o})/F_m

Cela peut fournir un indicateur important de la fonction du photosystème et du stress. L’allumage d’une lumière actinique (photosynthétique) stimule la trempe non photochimique, et l’application ultérieure d’un flash saturant permet de mesurer la fluorescence maximale adaptée à la lumière, F m’. En comparant la différence entre la fluorescence maximale sombre et la fluorescence maximale adaptée à la lumière, le NPQ peut être calculé selon l’équation de Stern-Volmer¹⁰ :

NPQ = F_m/F_m‘ – 1

Dans les usines supérieures, le NPQ a été décrit comme composé d’au moins cinq composants distincts, notamment qE, qT, qZ, qI et qH. Les mécanismes précis impliqués dans le NPQ ne sont pas entièrement compris; cependant, le qE est considéré comme le principal composant du NPQ dans la plupart des usines. Des facteurs cruciaux pour un engagement complet de l’QE comprennent l’accumulation d’un gradient de protons à travers la membrane thylakoïde, l’activité de la sous-unité S^11,12 du photosystème II et les xanthophylles époxydées, l’anthéroaxanthine, la lutéine et en particulier la zéaxanthine¹³. Le qE se détend le plus rapidement de tous les composants NPQ (< 2 min)¹⁴, et l’activation réversible du qE est donc particulièrement importante pour l’adaptation aux intensités lumineuses changeantes. Une deuxième phase plus lente de relaxation NPQ (~2-30 min) englobe à la fois qT, liée aux transitions d’état, et qZ, impliquant l’interconversion de la zéaxanthine en violaxanthine¹⁵. La relaxation lente (> 30 min) de NPQ peut inclure à la fois une trempe photoinhibitoire (qI)¹⁶ et des processus indépendants des photodommages^17,18, tels que qH, qui est une trempe soutenue dans les antennes périphériques du PSII médiée par une protéine de lipocaline plaste^19,20.

NPQ augmente pendant l’exposition à la lumière élevée. Le transfert ultérieur à une faible luminosité peut entraîner une régulation négative du NPQ. La désintégration des phases de relaxation rapides, intermédiaires et lentes peut être capturée dans les paramètres d’une fonction bi-exponentielle 15,21,22,23

NPQ = Aq1^(-t/τ1) + Aq2^(-t/τ2) + Aq3

La base théorique de la fonction bi-exponentielle est basée sur l’hypothèse de l’utilisation de premier ordre de quenchers hypothétiques, y compris qE (Aq1), la relaxation combinée de qZ et qT (Aq2), avec les constantes de temps correspondantes τq1 et τq2, et NPQ à long terme, qui comprend qI et des processus indépendants de photodommages (Aq3). En tant que telle, la fonction bi-exponentielle fournit une représentation plus réaliste des multiples processus biologiques connectés impliqués dans l’extinction de la fluorescence de la chlorophylle par rapport à une équation de Hill plus simple qui manque d’une base théorique²⁴.

Le NPQ peut être mesuré à l’aide d’une variété de fluoromètres PAM^25,26 disponibles ^dans le commerce, des simples appareils portatifs²⁷ aux systèmes fermés plus avancés²⁸. Cependant, une limitation de plusieurs de ces approches est un débit relativement faible, ce qui rend difficile le criblage de grandes collections de plantes sans plusieurs dispositifs et une équipe de chercheurs. Pour résoudre ce problème, McAusland et al. ont développé une procédure basée sur le tissu foliaire excisé et l’ont utilisée pour identifier les différences de fluorescence de la chlorophylle entre deux cultivars de blé²⁹. L’attrait de cette approche est que l’imagerie des disques de feuilles, prélevés sur plusieurs plantes avec un seul appareil, peut faciliter le dépistage de centaines de génotypes en une journée. Cela permet d’évaluer la variation de la relaxation du NPQ dans le cadre d’études d’association à l’échelle du génome, ou de dépister les populations reproductrices ayant le potentiel d’augmenter l’efficacité photosynthétique des cultures et, en fin de compte, le rendement.

En nous appuyant sur les résultats de McAusland et ^al.29, nous utilisons l’analyse de fluorescence de la chlorophylle PAM des disques foliaires pour le criblage à haut débit des taux de relaxation NPQ dans Glycine max (G.max; soja). Ce protocole utilise le CF Imager²⁵, qui est comparable à d’autres systèmes PAM fermés disponibles dans le commerce, tels que le populaire FluorCam²⁶. Avec une pièce sombre pour l’adaptation des échantillons, les utilisateurs peuvent imager des assiettes à 96 puits, des boîtes de Petri et de petites plantes. Le principal avantage de cette approche est l’augmentation du débit offerte par l’utilisation de disques de feuilles par rapport à l’analyse séquentielle de plantes individuelles. Nous présentons ici des résultats représentatifs et une méthode d’échantillonnage, de mesure et d’analyse du NPQ dans les plantes cultivées en plein champ.

Protocol

1. Plantation de semences Choisissez un site de champ avec un sol fertile, bien drainé, mais pas sablonneux, et avec un pH de près de 6,5. Marquez les parcelles en rangée de 1,2 m avec un espacement de 0,75 m en marquant le sol avec une houe. Plantez 50 graines/m de G.max cv. IA3023 à 3 cm de profondeur le long de chaque parcelle au début de la saison de croissance lorsque les températures du sol sont comprises entre 25 et 30 °C.REMARQUE: Aux fins du dépistage de …

Representative Results

La figure 1A illustre une mesure typique du NPQ dans le soja cultivé en plein champ. Les plantes ont été cultivées à Urbana, IL (latitude 40.084604°, longitude -88.227952°) au cours de l’été 2021, avec des graines plantées le 5 juin. 2021. Les disques de feuilles ont été échantillonnés après 30 jours de plantation de semences, et des mesures ont été effectuées avec le protocole fourni (tableau 1). Les valeurs Fv/Fm et NPQ ont été calcu…

Discussion

Un choix et une manipulation minutieux des disques de feuilles sont essentiels pour obtenir des mesures fiables du NPQ. Tout d’abord, les dommages aux tissus, tels qu’une manipulation brutale avec une pince à épiler, introduiront un stress, ce qui entraînera de faibles valeurs pour l’efficacité quantique maximale de la photosynthèse. Les plantes non stressées ont généralement des valeurs F_v/F_m d’environ 0,83¹⁸, avec des baisses significatives…

Materials

24 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012929	Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012931	Country of Origin: United States of America
Aluminum foil	Antylia Scientific	61018-56	Country of Origin: United States of America
Black marker pen	Sharpie	SAN30001	Country of Origin: United States of America
CF imager	Technologica Ltd.	N/A	chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm	Humboldt Mfg Co	H9665	Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software	Technologica Ltd.	N/A	imaging software Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters	Amazon	B07P6XCTGV	Country of Origin: United States of America
Marker stakes	John Henry Company	KN0151	Country of Origin: United States of America
Paper scissors	VWR	82027-596	Country of Origin: United States of America
Parafilm	Bemis Company Inc.	S3-594-6	Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers	Fisher Scientific	14-130M	Country of Origin: United States of America