הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה למדידת הרפיה של מרווה לא פוטוכימית על ידי פלואורומטריה של כלורופיל מווסתת משרעת פולסים. השיטה מיושמת על גליצין מקס שגדל בשדה וניתן להתאים אותה למינים אחרים כדי לסנן מגוון גנטי או אוכלוסיות רבייה.
הפוטוסינתזה אינה מותאמת לזני יבול מודרניים, ולכן מספקת הזדמנות לשיפור. האצת ההרפיה של מרווה לא פוטוכימית (NPQ) הוכיחה את עצמה כאסטרטגיה יעילה להגברת הביצועים הפוטוסינתזיים. עם זאת, הפוטנציאל להתרבות לשיפור ה-NPQ והבנה מלאה של הבסיס הגנטי של הרפיית NPQ לוקה בחסר בשל מגבלות של דגימת יתר ואיסוף נתונים מצמחי יבול שגדלו בשדה. בהתבסס על דיווחים קודמים, אנו מציגים בדיקה בתפוקה גבוהה לניתוח שיעורי הרפיה של NPQ בגליצין מקסימום (סויה) באמצעות פלואורומטריה של כלורופיל מווסת משרעת פולסים (PAM). דיסקי עלים נדגמים מפולי סויה שגודלו בשדה לפני הובלתם למעבדה שבה הרפיית NPQ נמדדת בפלואורומטר PAM סגור. פרמטרי הרפיית NPQ מחושבים על-ידי התאמת פונקציה דו-מעריכית לערכי NPQ הנמדדים לאחר מעבר מאור גבוה לתאורה נמוכה. באמצעות שיטה זו, ניתן לבחון מאות גנוטיפים בתוך יום. להליך יש פוטנציאל לסנן לוחות מוטציה וגיוון לשינויים בהרפיית NPQ, ולכן ניתן ליישם אותו הן בשאלות מחקר בסיסיות והן בשאלות מחקר יישומיות.
הפוטוסינתזה מורכבת מבליעת אור, העברת אלקטרונים ראשונית, ייצוב אנרגיה וסינתזה והובלה של תוצרים פוטוסינתטיים1. הבנת כל שלב היא חיונית כדי להנחות את המאמצים להגברת היעילות הפוטוסינתזית של היבול. האור משפיע על קצב הפוטוסינתזה, ודורש איזון בין אספקת האנרגיה, בצורה של פוטונים, לבין הביקוש להפחתת שווה ערך. כאשר ההיצע עולה על הביקוש, למשל תחת תאורה גבוהה או במהלך קיבוע CO2 מופחת הנגרם על ידי סגירה סטומהטלית, הצטברות של הפחתת כוח מגדילה את ההסתברות להיווצרות מיני חמצן תגובתי עם פוטנציאל לפגוע במנגנון הפוטוסינתזה ולפגוע בהובלת אלקטרונים. לכן, כדי למנוע נזק, צמחים פיתחו מספר מנגנוני הגנה פוטו-מגנים, כולל ניקוי רעלים של מיני חמצן תגובתי ומרווה לא פוטוכימית של מצבי הכלורופיל הנרגשים (NPQ)2.
שמירה על שיעורים גבוהים של פוטוסינתזה היא מאתגרת בסביבת שדה. שינויים עונתיים ומשתנים, יחד עם תנודות סביבתיות כגון תנועות עלים הנגרמות על ידי הרוח וכיסוי עננים חולף, גורמים לשינויים בכמות האור ובעוצמת האור המתקבלים על ידי צמחים לצורך פוטוסינתזה3. NPQ מפזר אנרגיית אור עודפת ויכול לסייע במניעת נזקי צילום תוך שהוא מאפשר קצבים מתמשכים של פוטוסינתזה בתאורה גבוהה4. עם זאת, NPQ ממושך במהלך מעברים בתאורה גבוהה עד נמוכה ממשיך לפזר אנרגיה שיכולה לשמש להפחתת פחמן5. כתוצאה מכך, האצת ההרפיה של NPQ יכולה להגביר את היעילות של פוטוסינתזה6, מה שהופך את הרפיית NPQ ליעד אטרקטיבי לשיפור היבול.
ניתן להשתמש בניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל מווסת משרעת פולסים (PAM) כדי לחשב NPQ מפרמטרים הניתנים למדידה (טבלה משלימה 1 וטבלה משלימה 2)7,8,9. מאמר זה מתמקד בקביעת שיעורי הרפיית NPQ בצמחים הגדלים בשדה לצורך סינון השונות הטבעית בחיידק. עם זאת, ניתוח פלואורומטריה של PAM chlorophyll יכול לשמש גם למגוון רחב של מטרות, מיושם על מינים החל מאצות ועד צמחים גבוהים יותר, והוא נבדק במקום אחר 7,8,9.
בעלה או בתא מותאם כהה, מרכזי התגובה של מערכת הפוטו-מערכת II (PSII) פתוחים לקליטת אלקטרונים ואין NPQ. הפעלת אור מדידה בעוצמה נמוכה מעוררת פלואורסצנציה של כלורופיל תוך הימנעות מהובלת אלקטרונים דרך PSII. הפלואורסצנציה המינימלית שנרשמה במצב מותאם כהה זה מתוארת על ידי הפרמטר Fo. מריחת פולס אור בעוצמה גבוהה על עלה מותאם כהה יכולה להפחית במהירות את מאגר מקבל האלקטרונים היציב הראשון של קינון הקשור לאתר קינון A. זה חוסם באופן זמני את יכולת העברת האלקטרונים במרכזי התגובה של PSII, שאז אומרים שהם סגורים ואינם מסוגלים לקלוט אלקטרונים מפיצול מים. על ידי שימוש במשך דופק קצר, אין מספיק זמן כדי לעורר NPQ. הפלואורסצנציה הכלורופיל המתקבלת שקולה לערך המרבי המתקבל בהיעדר NPQ, או פלואורסצנציה מקסימלית, Fm. ההבדל בין פלואורסצנציה מינימלית למקסימום מכונה פלואורסצנציה משתנה, Fv. התפוקה הקוונטית הפוטוכימית המרבית של מערכת הפוטו-מערכת II (Fv/Fm) מחושבת משני הפרמטרים הללו באמצעות המשוואה הבאה:
Fv/Fm = (Fm-F o)/Fm
זה יכול לספק אינדיקציה חשובה לתפקוד מערכת הצילום ולמתח. הפעלת אור אקטיני (פוטוסינתטי) מגרה מרווה לא פוטוכימית, ויישום מאוחר יותר של הבזק רווי מאפשר מדידה של פלואורסצנציה מקסימלית מותאמת אור, Fm‘. על ידי השוואת ההפרש בין פלואורסצנציה מקסימלית בחושך לבין פלואורסצנציה מקסימלית המותאמת לאור, ניתן לחשב את NPQ על פי משוואת שטרן-וולמר10:
NPQ = Fm/Fm‘ – 1
בצמחים גבוהים יותר, NPQ תואר כמורכב מלפחות חמישה רכיבים נפרדים, כולל qE, qT, qZ, qI ו- qH. המנגנונים המדויקים המעורבים ב- NPQ אינם מובנים במלואם; עם זאת, qE נחשב למרכיב העיקרי של NPQ ברוב הצמחים. גורמים מכריעים למעורבות מלאה של qE נמצאו כוללים הצטברות של שיפוע פרוטון על פני הממברנה התילאקואידית, פעילות של תת-יחידה II של מערכת פוטו-מערכת II S 11,12, וקסנתופילים דה-אפוקסידיים, אנתראקסנטין, לוטאין, ובמיוחד זאקסנטין13. qE מרגיע את המהיר ביותר מכל רכיב NPQ (< 2 דקות)14, ולכן הפעלה הפיכה של qE חשובה במיוחד להסתגלות לעוצמות אור משתנות. שלב שני איטי יותר של הרפיית NPQ (כ-2-30 דקות) מקיף הן את qT, הקשור למעברי מצב, והן את qZ, הכולל היפוך הדדי של זאקסנטין לוויולאקסנטין15. הרפיה איטית (> 30 דקות) של NPQ עשויה לכלול הן מרווה פוטואינהיביטורית (qI)16 והן תהליכים שאינם תלויים בפוטו-דיאמג’ 17,18, כגון qH, שהוא מרווה מתמשכת באנטנות ההיקפיות של PSII המתווכת על ידי חלבון ליפוקלין פלסטי19,20.
NPQ עולה במהלך החשיפה לאור גבוה. העברה לאחר מכן לתאורה חלשה עלולה לגרום להנמכת הרגולציה של NPQ. ניתן ללכוד את הדעיכה של שלבים מרגיעים מהירים, בינוניים ואיטיים בפרמטרים של פונקציה דו-מעריכית 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
הבסיס התיאורטי לפונקציה הדו-מעריכית מבוסס על ההנחה של ניצול מסדר ראשון של מרווה היפותטית, כולל qE (Aq1), הרפיה משולבת של qZ ו-qT (Aq2), עם קבועי הזמן המתאימים τq1 ו-τq2, ו-NPQ לטווח ארוך, הכולל qI ותהליכים בלתי תלויים בפוטו-דאמג’ (Aq3). ככזו, הפונקציה הדו-מעריכית מספקת ייצוג מציאותי יותר של התהליכים הביולוגיים המחוברים המרובים המעורבים בהרוות פלואורסצנציה של כלורופיל בהשוואה למשוואת היל פשוטה יותר, אשר חסרה בסיס תיאורטי24.
ניתן למדוד NPQ באמצעות מגוון פלואורומטרים PAM הזמינים מסחרית25,26, החל ממכשירים ידניים פשוטים27 ועד למערכות סגורות מתקדמות יותר28. עם זאת, מגבלה של כמה מהגישות הללו היא תפוקה נמוכה יחסית, מה שהופך את הסינון של אוספים גדולים של צמחים למאתגר ללא מכשירים מרובים וצוות חוקרים. כדי לטפל בבעיה זו, McAusland et al. פיתחו הליך המבוסס על רקמת עלה שנכרתה והשתמשו בה כדי לזהות הבדלים בפלואורסצנציה של כלורופיל בין שני גזעי חיטה29. המשיכה של גישה זו היא שהדמיית דיסקים של עלים, שנלקחו מצמחים מרובים באמצעות מכשיר אחד, יכולה להקל על סינון מאות גנוטיפים תוך יום. זה מאפשר להעריך שונות בהרפיית NPQ כחלק ממחקרי אסוציאציה רחבה של הגנום, או לסינון אוכלוסיות רבייה עם פוטנציאל להגביר את היעילות הפוטוסינתזית של היבולים ובסופו של דבר להניב תשואה.
בהתבסס על הממצאים של McAusland et al.29, אנו משתמשים בניתוח פלואורסצנטי של PAM כלורופיל של דיסקות עלים לצורך סינון בתפוקה גבוהה של שיעורי הרפיה של NPQ בגליצין מקסימום (G.max; סויה). פרוטוקול זה משתמש ב- CF Imager25, הדומה למערכות PAM סגורות אחרות הזמינות מסחרית, כגון FluorCam26 הפופולרי. עם חדר חשוך להתאמת דגימות, המשתמשים יכולים לדמות צלחות של 96 בארות, צלחות פטרי וצמחים קטנים. היתרון העיקרי של גישה זו הוא הגידול בתפוקה המוענקת על ידי שימוש בדיסקות עלים בהשוואה לניתוח רציף של צמחים בודדים. כאן אנו מציגים תוצאות מייצגות, ושיטה לדגימה, מדידה וניתוח של NPQ בצמחים הגדלים בשדה.
בחירה וטיפול זהירים בדיסקי עלים הם קריטיים להשגת מדידות אמינות של NPQ. ראשית, נזק לרקמה, כגון טיפול גס בפינצטה, יגרום ללחץ, וכתוצאה מכך יהיו ערכים נמוכים ליעילות הקוונטית המרבית של הפוטוסינתזה. לצמחים שאינם לחוצים יש בדרך כלל ערכי Fv/Fm של כ-0.8318, כאשר ירידות מ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי פרויקט המחקר מימוש יעילות פוטוסינתטית מוגברת (RIPE) הממומן על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס, הקרן לחקר מזון וחקלאות, ומשרד החוץ, חבר העמים הבריטי והפיתוח תחת מספר מענק OPP1172157.
24 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012929 | Country of Origin: United States of America |
96 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012931 | Country of Origin: United States of America |
Aluminum foil | Antylia Scientific | 61018-56 | Country of Origin: United States of America |
Black marker pen | Sharpie | SAN30001 | Country of Origin: United States of America |
CF imager | Technologica Ltd. | N/A | chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom |
Cork-borer, 7mm | Humboldt Mfg Co | H9665 | Country of Origin: United States of America |
FluorImager V2.305 Software | Technologica Ltd. | N/A | imaging software Country of Origin: United Kingdom |
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters | Amazon | B07P6XCTGV | Country of Origin: United States of America |
Marker stakes | John Henry Company | KN0151 | Country of Origin: United States of America |
Paper scissors | VWR | 82027-596 | Country of Origin: United States of America |
Parafilm | Bemis Company Inc. | S3-594-6 | Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America |
Solid rubber stoppers | Fisher Scientific | 14-130M | Country of Origin: United States of America |