パルス振幅変調クロロフィル蛍光測定を用いた作物の非光化学的急冷のハイスループット分析
Summary
このプロトコルは、パルス振幅変調クロロフィル蛍光測定法による非光化学的消光の緩和を測定するためのハイスループット法を導入する。この方法は、野外で栽培された グリシンマックス に適用され、遺伝的多様性または繁殖集団をスクリーニングするために他の種に適応させることができる。
Abstract
光合成は現代の作物品種では最適化されていないため、改善の機会を提供します。非光化学消光(NPQ)の緩和をスピードアップすることは、光合成性能を向上させるための効果的な戦略であることが証明されています。しかし、NPQの改善とNPQ緩和の遺伝的基盤の完全な理解のために繁殖する可能性は、野外で栽培された作物植物からのオーバーサンプリングとデータ収集の制限のために欠けている。以前の報告に基づいて、我々は、パルス振幅変調(PAM)クロロフィル蛍光測定法を用いて グリシンマックス (大豆)におけるNPQ緩和率を分析するためのハイスループットアッセイを提示する。葉のディスクは、NPQ緩和が閉じたPAM蛍光光度計で測定される実験室に輸送される前に、畑で栽培された大豆からサンプリングされます。NPQ緩和パラメータは、高輝度から低照度への移行後に測定されたNPQ値に双指数関数を当てはめることによって計算されます。この方法を使用すると、1日以内に何百もの遺伝子型を検査することができます。この手順は、NPQ緩和の変動について変異体および多様性パネルをスクリーニングする可能性を秘めているため、基礎研究と応用研究の両方の質問に適用することができます。
Introduction
光合成は、光吸収、一次電子移動、エネルギー安定化、光合成産物の合成と輸送からなる1.各ステップを理解することは、作物の光合成効率を高めるための努力を導くために不可欠です。光は光合成の速度に影響し、光子の形でのエネルギー供給と等価物を減らすための需要のバランスをとる必要があります。供給が需要を超える場合、例えば、高光下または気孔閉鎖によって引き起こされるCO2 固定の減少中に、還元力の蓄積は、光合成装置を損傷し、電子輸送を損なう可能性のある活性酸素種形成の可能性を高める。したがって、損傷を防ぐために、植物は活性酸素種の無害化および励起クロロフィル状態(NPQ)2の非光化学的消光を含むいくつかの光保護機構を開発した。
光合成を高い速度で維持することは、フィールド環境下では困難です。季節的および日周的な変化は、風による葉の動きや一時的な雲量などの環境変動とともに、植物が光合成のために受け取る光の量と強度に変化を引き起こします3。NPQは余分な光エネルギーを放散し、ハイライト4での光合成の持続速度を可能にしながら、光損傷を防ぐのに役立ちます。しかし、高光から低照度の遷移中にNPQが長引くと、炭素削減に使用できるエネルギーが散逸し続けます5。その結果、NPQの緩和を高速化することで、光合成6の効率を高めることができ、NPQ緩和は作物改良のための魅力的なターゲットとなる。
パルス振幅変調クロロフィル蛍光(PAM)分析は、測定可能なパラメータ(補足表1および補足表 2)7、8、9からNPQを計算するために使用することができる。本稿では、生殖質の自然変動をスクリーニングする目的で、野外植物におけるNPQ緩和率の決定に焦点を当てる。しかしながら、PAMクロロフィル蛍光測定分析は、藻類から高等植物に至るまでの種に適用され、多種多様な目的にも使用することができ、他の場所でレビューされている7、8、9。
暗く適応した葉や細胞では、光系II(PSII)反応中心は電子を受け取るために開いており、NPQはありません。低強度の測定光をオンにすると、PSIIを介した電子輸送を回避しながらクロロフィル蛍光を誘発します。この暗適応状態で記録された最小蛍光は、パラメータFoによって記述される。暗に適応した葉に高強度の光パルスを印加すると、キノンA部位に結合したキノンの第一の安定電子受容体プールを急速に減少させることができる。これは、PSII反応中心における電子移動能力を一時的に遮断し、PSII反応中心は閉鎖的であり、水分解から電子を受け取ることができないと言われる。短いパルス持続時間を使用することにより、NPQを刺激するのに十分な時間がない。得られたクロロフィル蛍光は、NPQの非存在下で得られる最大値、または最大蛍光、Hmに相当する。最小蛍光と最大蛍光の差は、可変蛍光Fvと呼ばれます。光系IIの最大光化学量子収率(Fv/Fm)は、次の式を使用してこれら2つのパラメータから計算されます。
Fv/F m = (F m-Fo)/F m
これは、光系の機能とストレスの重要な指標を提供することができます。活性(光合成)光をオンにすると、非光化学的消光が刺激され、その後の飽和フラッシュの適用により、光に適応した最大蛍光Fm‘の測定が可能になります。暗と光に適合した最大蛍光の差を比較することにより、NPQはスターン・ボルマー式10に従って計算できます。
NPQ = F m/Fm‘ – 1
高等植物では、NPQはqE、qT、qZ、qIおよびqHを含む少なくとも5つの異なる成分からなると記載されている。NPQに関わる正確なメカニズムは完全には理解されていません。しかし、qEはほとんどの植物においてNPQの主要な構成要素であると考えられている。qEの完全な関与のための重要な要因には、チラコイド膜を横切る陽子勾配の蓄積、光系IIサブユニットS11,12の活性、および脱エポキシ化キサントフィル、アンテラキサンチン、ルテイン、および特にゼアキサンチン13が含まれることが見出されている。qEはNPQ成分の中で最も速く(<2分)14を緩和し、したがってqEの可逆的活性化は光強度のシフトへの適応にとって特に重要である。NPQ緩和の第2のより遅い段階(〜2〜30分)は、状態遷移に関連するqTと、ゼアキサンチンからビオラキサンチン15への相互変換を伴うqZの両方を包含する。NPQの緩慢弛緩(>30分)は、プラスチドリポカリンタンパク質19,20によって媒介されるPSIIの末梢アンテナにおける持続的な消光であるqHなどの光損傷17,18とは無関係の光阻害性消光(qI)16およびプロセスの両方を含み得る。
NPQは、高光に曝されると増加します。その後の低照度への転送は、NPQのダウンレギュレーションにつながる可能性があります。高速、中間、および低速の緩和位相の減衰は、双指数関数15,21,22,23のパラメータに取り込むことができます。
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
双指数関数の理論的基礎は、qE(Aq1)、qZとqTの結合緩和(Aq2)、対応する時定数τq1とτq2、およびqIと光損傷に依存しないプロセス(Aq3)を含む長期NPQを含む仮説的なクエンチャーの一次利用の仮定に基づいています。このように、双指数関数は、理論的根拠を欠いているより単純なヒル方程式と比較して、クロロフィル蛍光の消光に関与する複数の接続された生物学的プロセスのより現実的な表現を提供する24。
NPQは、単純なハンドヘルド装置27からより高度なクローズドシステム28まで、様々な市販のPAM蛍光光度計25、26を用いて測定することができる。しかし、これらのアプローチのいくつかの制限は、比較的低いスループットであり、複数のデバイスと研究者のチームなしで植物の大規模なコレクションをスクリーニングすることは困難です。この問題に対処するために、McAuslandらは、摘出した葉組織に基づく手順を開発し、それを使用して、2つの小麦品種間のクロロフィル蛍光の違いを同定した29。このアプローチの魅力は、単一の装置で複数の植物から採取されたイメージングリーフディスクが、1日以内に何百もの遺伝子型のスクリーニングを容易にすることができることです。これにより、ゲノムワイド関連研究の一環としてNPQ緩和の変動を評価したり、作物の光合成効率を高め、最終的に収量を増加させる可能性のある育種集団をスクリーニングしたりすることができます。
McAusland et al.29の知見に基づいて、我々はグリシンマックス(G.max;ダイズ)におけるNPQ緩和率のハイスループットスクリーニングのために、葉ディスクのPAMクロロフィル蛍光分析を使用する。このプロトコルは、一般的なFluorCam26などの他の市販のクローズドPAMシステムに匹敵するCFイメージャ25を使用します。サンプルを適応させるための暗い部屋で、ユーザーは96ウェルプレート、ペトリ皿、小さな植物を画像化できます。このアプローチの主な利点は、個々のプラントのシーケンシャル分析と比較して、リーフディスクを使用することによって得られるスループットの増加です。本明細書では、代表的な結果、および野外栽培植物におけるNPQのサンプリング、測定、および分析のための方法を提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
リーフディスクの慎重な選択と取り扱いは、NPQの信頼性の高い測定値を得るために重要です。第一に、ピンセットによる粗い取り扱いなどの組織への損傷は、ストレスをもたらし、光合成の最大量子効率のための低い値をもたらす。非ストレス植物は、典型的には、約0.8318のFv/Fm値を有し、有意な低下は光合成性能の低下を示す9</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Bill & Melinda Gates Foundation、Foundation for Food and Agriculture Research、および英国外国、連邦および開発局が助成金番号OPP1172157で資金提供している研究プロジェクトRealize Increasing Photosynthetic Efficiency(RIPE)によって支援されています。
Materials
| 24 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012929 | Country of Origin: United States of America |
| 96 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012931 | Country of Origin: United States of America |
| Aluminum foil | Antylia Scientific | 61018-56 | Country of Origin: United States of America |
| Black marker pen | Sharpie | SAN30001 | Country of Origin: United States of America |
| CF imager | Technologica Ltd. | N/A | chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom |
| Cork-borer, 7mm | Humboldt Mfg Co | H9665 | Country of Origin: United States of America |
| FluorImager V2.305 Software | Technologica Ltd. | N/A | imaging software Country of Origin: United Kingdom |
| iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters | Amazon | B07P6XCTGV | Country of Origin: United States of America |
| Marker stakes | John Henry Company | KN0151 | Country of Origin: United States of America |
| Paper scissors | VWR | 82027-596 | Country of Origin: United States of America |
| Parafilm | Bemis Company Inc. | S3-594-6 | Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America |
| Solid rubber stoppers | Fisher Scientific | 14-130M | Country of Origin: United States of America |
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